黄老师3版基因工程

1、1第第 二十一二十一 章章基因工程生物化学与分子生物学生物化学与分子生物学 黄诒森主编黄诒森主编2 将一种生物的基因与将一种生物的基因与载体分子在体外进行拼载体分子在体外进行拼接重组，转入另一生物接重组，转入另一生物体细胞内使之扩增并表体细胞内使之扩增并表达新的性状。达新的性状。 是生物技术领域的是生物技术领域的核核心技术心技术。基因工程基因工程genetic engineering供体、受体、载体供体、受体、载体是是dna重组技术的三大基本元件。重组技术的三大基本元件。 在体外将不同来源的在体外将不同来源的dna分子通过磷酸二酯分子通过磷酸二酯键连接成一个新的键连接成一个新的dna分子。分子

2、。 以获得单一基因或以获得单一基因或dna片段的大量拷贝为片段的大量拷贝为目的，故称为基因克隆目的，故称为基因克隆或分子克隆。或分子克隆。dna重组重组dna recombination 3基因工程基因工程genetic engineering广义：广义：包括两大部分包括两大部分上游技术上游技术: 外源基因的克隆、重组、表达的设计与构外源基因的克隆、重组、表达的设计与构建（即狭义的基因工程或重组建（即狭义的基因工程或重组dna技术）技术）下游技术下游技术: 含外源基因的重组菌或细胞的大规模培养含外源基因的重组菌或细胞的大规模培养以及外源基因表达产物的分离纯化与鉴定等工艺。以及外源基因表达产物的

3、分离纯化与鉴定等工艺。蛋白质工程（蛋白质工程（protein engineering）：）：利用克隆基因表达、制备特定的蛋白质或多肽，或定向改造利用克隆基因表达、制备特定的蛋白质或多肽，或定向改造基因结构获得新的蛋白质或蛋白质的新性质。基因结构获得新的蛋白质或蛋白质的新性质。45第一节第一节 基因克隆的工具酶基因克隆的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割dnadna连接酶连接酶催化催化dna中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷羟基末端之间形成磷酸二酯键，使酸二酯键，使dna切口封合或使两个切口封合或使两个dn

4、a分子或片段分子或片段连接连接dna聚合酶聚合酶合成双链合成双链cdna分子或片段连接；缺口平移制作高比活分子或片段连接；缺口平移制作高比活探针；探针；dna序列分析；填补序列分析；填补3 末端末端klenow片段（片段（dna聚合酶聚合酶i大片段）大片段）具有具有53 聚合、聚合、35 外切活性，无外切活性，无53 外切活性。外切活性。常用于常用于cdna第二链合成，双链第二链合成，双链dna 3 末端标记等末端标记等逆转录酶逆转录酶合成合成cdna；替代替代dna聚合酶聚合酶i进行填补，标记或进行填补，标记或dna序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5

5、羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针6一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶restriction endonuclease 一类能一类能识别识别双链双链dnadna分子内部的分子内部的特异序列特异序列，并在并在识别位点或其周围识别位点或其周围产生产生切割切割作用的作用的核酸水解酶核酸水解酶。 存在于多种存在于多种细菌细菌中，与相伴的中，与相伴的甲基化酶甲基化酶共同构成细菌的共同构成细菌的“限制限制- -修饰修饰”体系体系，保护自身，保护自身dnadna，分解外来，分解外来dnadna。 维持细菌遗传性状的稳定遗传。维持细菌遗传性状的稳定遗传。（一）概念（一）概念基因工程的手

6、术刀基因工程的手术刀 7命名命名基本原则：基本原则：3-4个字母组成个字母组成: 属名属名+种名种名+株名株名+序号序号如：如：ecor : escherichia coli r (大肠杆菌大肠杆菌r株株) =escherichia，埃希菌属，埃希菌属 细菌细菌属名属名第一个字母，第一个字母，co=coli，大肠杆菌菌种，大肠杆菌菌种 细菌细菌种名种名头二个字母，头二个字母，r= ry13 细菌细菌株名株名头一个字母，头一个字母，i=第一个分离到的内切酶第一个分离到的内切酶 酶被发现的先后酶被发现的先后顺序顺序 （二）命名与分类（二）命名与分类8 分类分类 i类：类：分子量大，识别位点复杂，特

7、异性差分子量大，识别位点复杂，特异性差类类：分子量小，分子量小，识别位点与切割位点识别位点与切割位点特异、固定特异、固定，切，切割作用发生在识别位点范围内。割作用发生在识别位点范围内。识别序列识别序列4-6个碱基对，个碱基对，具有回文结构。具有回文结构。类类：分子量大，酶活性不单一，如分子量大，酶活性不单一，如ecop1 根据酶的结构、所需因子及裂解根据酶的结构、所需因子及裂解dna方式的不同方式的不同可分为可分为 i、ii、iii类类限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶9两种切割方式：两种切割方式：错位切，垂直切错位切，垂直切 黏端切口、平端切口黏端切口、平端切口bam hgtccaggccta

8、ggatcc gggatcccctagghindgtcgaccagctggacctg平头平头/钝性末端钝性末端(blunt end)黏性末端黏性末端(sticky end,cohesive end)10bam h基因工程的手术刀基因工程的手术刀 ggatcccctagg5533-oh gcctag53-pgatcc gp-53ho-11ecor 的切割位点的切割位点5 g-c-t-g-a-a-t-t-c-g-a-g 33 c-g-a-c-t-t-a-a-g-c-t-c 55 g-c-t-g-oh p-a-a-t-t-c-g-a-g 33 c-g-a-c-t-t-a-a-p oh-g-c-t-c

9、 5 5 g-c-t-g -a-a-t-t-c-g-a-g 33 c-g-a-c-t-t-a-a g-c-t-c 5oh pohpecor 切割产生切割产生5粘性末端粘性末端位点位点ecor,37ecor,37c c退火，退火，4-74-7c c5 g-c-t-c-t-g-c-a-g-g-a-g 33 c-g-a-g-a-c-g-t-c-c-t-c 55 g-c-t-c-t-g-c-a-oh p-g-g-a-g 33 c-g-a-g-p oh-a-c-g-t-c-c-t-c 5 5 g-c-t-c-t-g-c-a-g-g-a-g 33 c-g-a-g-a-c-g-t-c-c-t-c 5oh p

10、ohppst切割产生切割产生3粘性末端粘性末端位点位点pst37pst37c退火退火4-74-7c5 g-c-t-c-a-g-c-t-g-g-a-g 33 c-g-a-g-t-c-g-a-c-c-t-c 55 g-c-t-c-a-g-oh p-c-t-g-g-a-g 33 c-g-a-g-t-c-p oh-g-a-c-c-t-c 5 pvu 产生的产生的平头末端平头末端pvu pvu ，37c155-粘性末端粘性末端酶酶taq icla imbo ibglbamhibcl ihind识别序列识别序列t/cgaat/cgat/gatca/gatctg/gatcct/gatcaa/agctt3粘性

11、末端粘性末端酶酶pst isac isph ibde iapa ikpn i 识别序列识别序列ctgca/ggagct/cgcatg/cggcgc/cgggcc/cggtac/c 平末端平末端酶酶alu ifnuddpn ihae pvu sma inae i识别序列识别序列ag/ctcg/cgga/tcgg/cccag/ctgccc/ggcgcc/ggc某些限制性内切酶及产生的末端某些限制性内切酶及产生的末端 16二、其他工具酶二、其他工具酶（二）（二）dnadna聚合酶聚合酶1.dna1.dna聚合酶聚合酶 大肠埃希菌大肠埃希菌dnadna聚合酶聚合酶是单一肽链的多功能酶，是单一肽链的多功

12、能酶，928928个氨基酸。有个氨基酸。有3 3个相对独立的活性中心，分别具个相对独立的活性中心，分别具有有5353聚合酶活性，聚合酶活性，3535和和5353核酸核酸外切酶活性。外切酶活性。 klenowklenow片段（大片段）指羧基末端片段（大片段）指羧基末端604604个氨基酸，个氨基酸，保留保留5353聚合酶活性，也有聚合酶活性，也有3535核酸外切核酸外切酶活性。酶活性。17klenowklenow片段是分子生物学研究的常用工具。片段是分子生物学研究的常用工具。用途：用途：合成合成cdna的第二条链的第二条链修复修复dna片段片段3末端（校对活性）末端（校对活性）标记探针标记探针3

13、末端末端dna序列分析序列分析182.taq-dna2.taq-dna聚合酶聚合酶(taq(taq酶酶) ) 耐热的聚合酶，具有耐热的聚合酶，具有5353聚合酶活性和聚合酶活性和5353核酸外切酶活性，热稳定性好核酸外切酶活性，热稳定性好，最佳温度，最佳温度70-8070-80，pcrpcr中最常用中最常用, ,无无3535外切酶活性，无外切酶活性，无校正功能。校正功能。193.3.逆转录酶逆转录酶 依赖依赖rnarna的的dnadna聚合酶，合成互补聚合酶，合成互补dnadna（complementary dnacomplementary dna，cdnacdna）。）。功能：功能： 逆转录

14、作用：逆转录作用： 5353合成合成cdnacdna单链单链 核酸酶核酸酶h h的水解作用：的水解作用： 3535水解杂化双链中的水解杂化双链中的rnarna 依赖依赖dnadna的的dnadna聚合酶作用：以杂化双链中的聚合酶作用：以杂化双链中的dnadna为模板，催为模板，催化合成化合成cdnacdna的互补链。的互补链。204.4.末端转移酶（末端转移酶（tdttdt） 末端脱氧核苷酰转移酶，不需要模板的末端脱氧核苷酰转移酶，不需要模板的dnadna聚合酶。聚合酶。将脱氧核苷酸加到单、双链将脱氧核苷酸加到单、双链dnadna分子的分子的3-oh3-oh上，用上，用于于标记探针标记探针和和

15、构建黏性末端构建黏性末端。211.dna1.dna连接酶（连接酶（dna ligasedna ligase） 一种封闭一种封闭dnadna链上缺口的酶，催化链上缺口的酶，催化dnadna中相邻的中相邻的55磷酸基和磷酸基和33羟基末端形成磷酸二酯键。羟基末端形成磷酸二酯键。大肠杆菌大肠杆菌dna连接酶：连接酶：在在dna聚合酶聚合酶1催化聚合填满双链催化聚合填满双链dna 上上的单链间隙后封闭的单链间隙后封闭dna双链上的单双链上的单链缺口，在链缺口，在dna复制、修复和重组复制、修复和重组中起作用。辅基为中起作用。辅基为nad+。t4连接酶：连接酶：连接双链连接双链dna分子分子的黏性末端或

16、平末端。需的黏性末端或平末端。需atp。（二）（二）dnadna连接酶连接酶22（三）碱性磷酸酶（三）碱性磷酸酶（alkaline phosphatasealkaline phosphatase） 切除核酸末端的切除核酸末端的5-5-磷酸基团。可有效防止载体磷酸基团。可有效防止载体自身磷酸化，提高重组效率。自身磷酸化，提高重组效率。23（四）核酸酶（四）核酸酶s1s1 一种高度单链特异的核酸内切酶。一种高度单链特异的核酸内切酶。功能： 单链水解功能，作用于双链核酸分子的单链区，并从单链部位切断核酸分子，单链区可以小到只有一个碱基对的程度。 用于分析核酸杂交分子(rna-dna)的结构、给rna

17、分子定位、去除dna片段中突出的单链尾产生平端、打开在双链cdna合成期间形成的发夹环。24载体：载体： 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些达有意义的蛋白质所采用的一些dnadna分子。分子。常用载体常用载体 质粒质粒dna 噬菌体噬菌体dna 病毒病毒dna第二节基因克隆的载体第二节基因克隆的载体25 能稳定自主复制，有较高拷贝数；能稳定自主复制，有较高拷贝数； 有克隆位点（外源有克隆位点（外源dnadna插入点），常具有多个单一插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；酶切位点，称为多克隆位点； 具有两个以上的遗传标记物

18、，便于重组体的筛选具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；和鉴定； 分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源dnadna。载体的选择标准载体的选择标准天然质粒、噬菌体、病毒需经人工改构才可用作载体天然质粒、噬菌体、病毒需经人工改构才可用作载体26 克隆载体克隆载体(cloning vector)(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源dnadna序列序列被扩增被扩增而特意设而特意设计的载体称为计的载体称为克隆载体克隆载体。 表达载体表达载体(expression vector)(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源dnad

19、na序列可序列可转录翻译转录翻译成多成多肽链而特意设计的载体称为肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。载体的分类载体的分类穿梭载体：含有原核和真核细胞的复制元件。穿梭载体：含有原核和真核细胞的复制元件。 27 存在于细菌中、独立于染色体、能存在于细菌中、独立于染色体、能自主复制自主复制的的双链环状双链环状dna分子。分子。1. 1. 质粒质粒(plasmid)(plasmid) 一、克隆载体一、克隆载体分分2类：类： 严格控制型：复制与宿主的繁严格控制型：复制与宿主的繁殖偶联，拷贝数少殖偶联，拷贝数少 松弛控制型：复制与宿主的繁松弛控制型：复制与宿主的繁殖不偶联，拷贝数多殖不偶联，拷贝数多

20、多克隆位点多克隆位点选择性基因选择性基因复制起点复制起点28优点：优点：分子量小分子量小易提取，易提取，有耐药性标志有耐药性标志易导入宿主易导入宿主缺点：缺点：插入的外援基插入的外援基因不超过因不超过10kbpbr322物理图谱物理图谱29puc18质粒物理图谱质粒物理图谱大肠埃希菌克大肠埃希菌克隆载体隆载体puc系系列质粒，有氨列质粒，有氨苄西林抗性基苄西林抗性基因和大肠埃希因和大肠埃希菌菌laz基因。基因。30（1 1）噬菌体：噬菌体：双链线性双链线性dna,dna,两端有两端有互补单链黏性末端（互补单链黏性末端（coscos位点）位点）2. 2. 噬菌体噬菌体(phage)(phage)

21、 感染细菌的一类病毒感染细菌的一类病毒。 噬菌体噬菌体dna必须包装蛋白质外壳并成必须包装蛋白质外壳并成熟后才能感染细菌。感染时，熟后才能感染细菌。感染时，噬菌体噬菌体dna进入大肠埃希菌，其黏性末端环化成环状进入大肠埃希菌，其黏性末端环化成环状双链双链dna。 31野生型野生型噬菌体噬菌体dna及相应的及相应的噬菌体噬菌体dna图谱图谱 321.1.gtgt系列（系列（插入型，插入片段插入型，插入片段6 kb6 kb，克隆效率高，克隆效率高，适用于适用于cdnacdna克隆，克隆， gt 10gt 10为代表，有为代表，有ecor iecor i但一位但一位点）点）2.2.emblembl系

22、列（系列（取代型，插入片段可达取代型，插入片段可达20 kb20 kb，适用于，适用于大片段基因组克隆，有大片段基因组克隆，有bamh ibamh i、 ecor i ecor i 和和salsal位位点）点）3.3.黏性质粒黏性质粒（cosmidcosmid）（由）（由dnadna的的coscos区与质粒重构区与质粒重构而成的双链环状而成的双链环状dnadna载体，既有质粒特点，又能像噬载体，既有质粒特点，又能像噬菌体一样体外包装。克隆容量大，达菌体一样体外包装。克隆容量大，达40-50kb40-50kb，用于，用于构建基因组文库）构建基因组文库）人工改造人工改造噬菌体噬菌体33（2 2）m

23、13m13噬菌体：噬菌体：dnadna改造系统：改造系统：序列排列紧密，改建仅限于基因序列排列紧密，改建仅限于基因之间之间作插入区作插入区m13mpm13mp系列（系列（插入插入e.e.colicoli的基因片段含的基因片段含laczlacz的基因）的基因）pucpuc系列系列 ( (利用利用pbr322pbr322和和m13m13载体的优点构建载体的优点构建) ) 单链闭环状单链闭环状dnadna m13感染宿主菌后在菌体内酶的作用下，以感染性感染宿主菌后在菌体内酶的作用下，以感染性单链单链dna为模板，复制转变为双链为模板，复制转变为双链dna，称为复制型，称为复制型（rf dna）；达到

24、一定拷贝时停止复制，产生大量）；达到一定拷贝时停止复制，产生大量单链单链dna并包装。并包装。 34（三）病毒载体（三）病毒载体 能感染动物细胞的病毒，可满足真核能感染动物细胞的病毒，可满足真核dna 重组重组生物需要。用于对肿瘤和遗传病的研究和治疗。生物需要。用于对肿瘤和遗传病的研究和治疗。常用的病毒载体：常用的病毒载体：猿猴空泡病毒（猿猴空泡病毒（sv40）逆转录病毒（逆转录病毒（retrovirus）昆虫杆状病毒昆虫杆状病毒腺病毒（腺病毒（adenovirus,av） 腺相关病毒（腺相关病毒（adeno-associated virus, aav）sv4035病毒载体构建时把细菌质粒复制

25、起始点放置其病毒载体构建时把细菌质粒复制起始点放置其中。改建后的病毒，含病毒启动子、包装元件、遗中。改建后的病毒，含病毒启动子、包装元件、遗传标记和质粒复制起始点。传标记和质粒复制起始点。36二、表达载体二、表达载体用于在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基用于在受体细胞中表达（转录和翻译）外源基因的载体。因的载体。必须具备必须具备克隆载体克隆载体的性质的性质必须带有必须带有转录转录和和翻译翻译所必需的元件所必需的元件对不同的表达系统要构建不同的表达载体对不同的表达系统要构建不同的表达载体1. 原核表达载体原核表达载体 常用大肠埃希菌表达载体。在克隆载体基础上还含有常用大肠埃希菌表达载体。在克隆

26、载体基础上还含有启动启动子子（trc启动子、启动子、t7噬菌体启动子等）、核糖体结合位点噬菌体启动子等）、核糖体结合位点（rbs）、转录终止序列等。）、转录终止序列等。37u sv40病毒载体：病毒载体：最终导致宿主细胞死亡，使用受限最终导致宿主细胞死亡，使用受限u 逆转录病毒载体：逆转录病毒载体：较高的整合和表达外源基因能力，要较高的整合和表达外源基因能力，要考虑安全性考虑安全性u 腺病毒载体：腺病毒载体：第三代去除所有腺病毒的编码基因，已用第三代去除所有腺病毒的编码基因，已用于基因治疗于基因治疗u avv载体载体：细小的：细小的dna病毒。无致病性，感染效率高，病毒。无致病性，感染效率高，

27、在基因治疗中广泛使用。在基因治疗中广泛使用。2. 真核表达载体真核表达载体 由克隆载体发展而来，包括原核生物的序列、真核表达调由克隆载体发展而来，包括原核生物的序列、真核表达调控的元件（启动子、增强子、转录终止、加控的元件（启动子、增强子、转录终止、加poly a信号序信号序列）、真核细胞的复制起始序列、真核筛选标志基因等。列）、真核细胞的复制起始序列、真核筛选标志基因等。38第三节第三节基因克隆的一般过程基因克隆的一般过程分分载体和目的基因的载体和目的基因的分分离离切切限制性内切酶限制性内切酶切切割割接接载体与目的基因连载体与目的基因连接接成重组体成重组体导导基因序列基因序列导导入细胞入细胞

28、筛筛目的基因序列克隆的目的基因序列克隆的筛筛选选鉴鉴对筛选出来的重组体进行对筛选出来的重组体进行鉴鉴定定 基本流程基本流程39切接导导筛分基本流程图示40一、目的基因的获取一、目的基因的获取目的基因又称外源基因，即我们所要研究的目的基因又称外源基因，即我们所要研究的感兴趣的基因。感兴趣的基因。从组织或器官中提取并分从组织或器官中提取并分离出某基因离出某基因dnadna或或cdnacdna目的基因目的基因dnadna41获取目的基因的方法获取目的基因的方法1.1.基因组基因组dna文库文库(genomic dna library)2.2.cdna文库文库(cdna library)3.3.聚合酶

29、链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, pcr)4.化学合成法（化学合成法（dna合成仪）合成仪）42基因组文库基因组文库(genomic dna library), 就是用基因就是用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组dna的各种片段的克隆群。即基因组的各种片段的克隆群。即基因组dna片段插片段插入克隆载体获得的分子克隆的总和。入克隆载体获得的分子克隆的总和。理想的基因组文库应包含该机体基因组的全理想的基因组文库应包含该机体基因组的全部遗传信息部遗传信息 。43基因组文库技术基因组文库技术(引自引自griffi

30、ths et al.1996) 构建基因组文库构建基因组文库分离染色体分离染色体dnadna，酶切，酶切片段化，与克隆载体连片段化，与克隆载体连接，所有重组接，所有重组dnadna分子分子导入宿主细胞并扩增，导入宿主细胞并扩增，建立建立基因组基因组dnadna文库文库。44以以mrnamrna为模板，利用为模板，利用反转录酶合成与反转录酶合成与mrnamrna互补的互补的dnadna（cdna)cdna)，再复制成双链再复制成双链cdnacdna片片段，与适当载体连接段，与适当载体连接后转入受体菌，即获后转入受体菌，即获得得cdnacdna文库文库。cdna文库构建文库构建(引自引自old &

31、 primrose,1980) 构建构建cdnacdna文库文库45适用于已知序列基因片段的获得适用于已知序列基因片段的获得变性变性退火退火延伸延伸敏感度高敏感度高, , 特异性强特异性强, , 产率高产率高, , 重复性好重复性好, , 快速简单快速简单pcr是一种利用酶促反应获得特异序列的基因组是一种利用酶促反应获得特异序列的基因组dna或或cdna的的专门技术。专门技术。 用用pcrpcr技术获取目的基因技术获取目的基因46化学合成法获取目的基因化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的dnadna序列序列47二、选择与制备合适的基因载体二、选择与制备合适

32、的基因载体选择载体的依据：选择载体的依据：1. 克隆的目的克隆的目的2. 合适的内切酶位点合适的内切酶位点3. 相应的宿主细胞相应的宿主细胞有众多人工构建的载体可选有众多人工构建的载体可选48基因克隆用细菌基因克隆用细菌质粒质粒染色体染色体提取载体提取载体质粒质粒dnadna质粒质粒dnadna质粒质粒是细菌染色体是细菌染色体外双链环状外双链环状dnadna，是基因工程最常用是基因工程最常用的载体之一。的载体之一。载体的分离载体的分离491. 对目的基因对目的基因dna和载体和载体dna进行酶切修饰进行酶切修饰目的目的dnadna限制性核限制性核酸内切酶酸内切酶质粒质粒dnadna基因克隆的载

33、体基因克隆的载体粘性末端粘性末端平末端平末端dnadna经过酶切后产经过酶切后产生两种形式的末端生两种形式的末端酶切后的质酶切后的质粒示意图粒示意图三、目的基因与克隆载体的连接三、目的基因与克隆载体的连接50酶切后的酶切后的质粒质粒dna简单表示为简单表示为重组质粒重组质粒同种限制酶酶切同种限制酶酶切目的基因目的基因和和载体载体，产生，产生相互对应的粘性相互对应的粘性末端，末端，退火后以退火后以dna连接酶连接酶共价互补连接。共价互补连接。2. 目的基因连接到载体的过程目的基因连接到载体的过程5152粘性末端粘性末端 同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接 不同限制内切酶位点连接不同限制内切

34、酶位点连接 同聚物加尾连接同聚物加尾连接 人工接头连接人工接头连接平端连接平端连接黏黏- -平末端连接平末端连接 53bam h切割反应切割反应 ggatcc cctaggt4 dna连接酶连接酶15cgatcc ggcctag载体载体dna用用 bam h切割切割gcctaggcctaggcctaggcctaggatccggatccggatccggatccg目的基因用目的基因用bam h切割切割gcctaggcctaggcctaggcctaggatccggatccggatccggatccg重组体重组体gcctaggcctaggatccggatccggcctaggcctaggatccggatc

35、cg载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接为防止载体自身环化，影响重组效率，可采取？54不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接gaattccttaagagatcttctagaeco r切割位点切割位点gcttaaatctagaattcggatctabg l切割位点切割位点aattcgatctagaattcggatctaaattcgatctagecor+ bg l双酶切双酶切eco r+ bg l双酶切双酶切gcttaaatctagaattcggatctat4 dna连接酶连接酶15c重组体重组体配伍末端的连配伍末端的连

36、接情况和同一限制酶接情况和同一限制酶切位点连接相似。切位点连接相似。重组效率和特重组效率和特异性均好。异性均好。55同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在的作用下，在dna片段末端加上同聚物序片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。人工接头人工接头(linker)连接连接在目的基因平端加上化学合成的含有一在目的基因平端加上化学合成的含有一种或一种以上酶切位点的平端双链寡核苷酸种或一种以上酶切位点的平端双链寡核苷酸片段，再用限制酶切除产生粘性末端，而进片段，再用限制酶切除产生

37、粘性末端，而进行粘端连接。行粘端连接。 biochem, jl gu. 200756目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶t4 dna连接酶连接酶15c重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连平端连接平端连接57黏黏-平末端连接平末端连接 目的基因插入载体可通过一端为黏端，一端为目的基因插入载体可通过一端为黏端，一端为平端的方式得到重组子。优点：目的基因定向插入，平端的方式得到重组子。优点：目的基因定向插入，避免自身环化。缺点：连接效率低避免自身环化。缺点：连接效率低58受体菌条件受体菌条件 安全宿主菌安全宿主菌 限制酶缺陷菌株（限制酶缺陷菌株（

38、r-）和重组缺陷（）和重组缺陷（rec-） 处于感受态处于感受态(competence)导入方式导入方式 重组重组dna导入大肠杆菌导入大肠杆菌-转化转化 (cacl2转化法转化法, 电穿孔法电穿孔法, 体外包装感染法体外包装感染法) 重组重组dna导入哺乳动物细胞导入哺乳动物细胞-转染转染 (dna-磷酸钙共沉淀磷酸钙共沉淀, 病毒感染法病毒感染法, 显微注射法，脂显微注射法，脂质体介导法质体介导法 ) 四、重组四、重组dnadna导入宿主细胞扩增导入宿主细胞扩增59重组质粒重组质粒细细 菌菌(cacl2处理）处理）细细 菌菌(cacl2处理）处理）质粒导入未成功质粒导入未成功质粒导入成功质

39、粒导入成功 转化过程中转化过程中, ,首先要将首先要将对数生长期对数生长期的细菌用的细菌用冷冷(4)(4)caclcacl2 2处理处理, ,改变细胞膜的通透性，使细改变细胞膜的通透性，使细菌处于容易吸收外源菌处于容易吸收外源dnadna的状态的状态感受态细胞感受态细胞。然后然后, ,在在4242进行热冲击进行热冲击(90(90秒秒),),将将质粒质粒导入细导入细菌内菌内. .但不是所有的细菌中都能同时成功地导入但不是所有的细菌中都能同时成功地导入质粒质粒. .因此产生两种状态的细菌：因此产生两种状态的细菌：含有质粒含有质粒的细的细菌和菌和不含有质粒不含有质粒的细菌。的细菌。60脂质体介导法：

40、用人工合成的脂质膜包裹袋转化的dna，形成脂质体结构，与受体细胞膜发生融合。61五、重组体的筛选与鉴定五、重组体的筛选与鉴定筛选含有目的基因的阳性克隆筛选含有目的基因的阳性克隆1.筛选含有筛选含有载体载体的克隆的克隆2.筛选含有筛选含有正确重组体正确重组体的克隆的克隆3.筛选带有筛选带有特异目的基因特异目的基因的克隆的克隆遗传学方法遗传学方法免疫学方法免疫学方法分子生物学方法分子生物学方法抗生素抗性筛选抗生素抗性筛选遗传标志补救筛选遗传标志补救筛选嗜菌斑筛选嗜菌斑筛选图谱分析、杂交检测、图谱分析、杂交检测、pcr、核酸测序、核酸测序62含含质粒的细菌质粒的细菌 不含不含质粒的细菌质粒的细菌含有

41、含有抗生素抗生素的培养基的培养基由于由于质粒质粒本身能本身能够编码产生分解够编码产生分解抗生素的酶，因抗生素的酶，因此，凡是此，凡是转化成转化成功功的细菌就能够的细菌就能够在含有抗生素的在含有抗生素的培养基中生长。培养基中生长。含含质粒的细菌（自身环化）质粒的细菌（自身环化）含有质粒者才能生存含有质粒者才能生存-筛选出含有筛选出含有质粒质粒的细菌克隆的细菌克隆抗生素抗性筛选抗生素抗性筛选63插入失活法插入失活法成活：质粒进成活：质粒进入细菌入细菌成活：重组质成活：重组质粒进入细菌粒进入细菌-筛选出含有筛选出含有重组体重组体的细菌克隆的细菌克隆抗生素抗性筛选抗生素抗性筛选64 互补互补( -co

42、mplementation)载体载体lacz编码编码 -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的氨基端氨基端片段片段宿主菌宿主菌lacz编码编码 -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的羧基端羧基端片段片段均均无无活活性性 各自编码的肽链可以融为一体，形成具有各自编码的肽链可以融为一体，形成具有 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶活活性的蛋白。性的蛋白。 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶可使可使特异性作用物变成特异性作用物变成蓝色蓝色化合物化合物遗传标志补救筛选：遗传标志补救筛选：标志补救标志补救(marker rescue)(marker rescue)克隆的基因若能在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌克隆的基因若能在宿主菌表达，且表达产

43、物与宿主菌的的营养缺陷互补营养缺陷互补，可利用营养突变菌株筛选。，可利用营养突变菌株筛选。655-5-嗅嗅-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚- - - -半乳糖苷半乳糖苷（含（含底物底物x-galx-gal培养基，无色培养基，无色) )蓝色菌落蓝色菌落 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶异丙基硫代异丙基硫代- - -d-d-半乳糖半乳糖（诱导剂诱导剂iptgiptg) )白色菌落clbrclbronno空载体空载体 + 宿主菌宿主菌 + x-gal + iptg 蓝斑蓝斑 重组体重组体 + 宿主菌宿主菌 + x-gal + iptg 白斑白斑 蓝白斑蓝白斑实验实验 互补互补66 互补互补重组体重组体质粒

44、67鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出免疫化学法（略）免疫化学法（略）68存活的含有质存活的含有质粒的细菌菌落粒的细菌菌落接种细菌接种细菌细细菌菌培培养养大量生长的细菌大量生长的细菌质粒质粒 提取提取含目的含目的dnadna无目的无目的dnadna酶切鉴定酶切鉴定获得含有目的获得含有目的基因基因dnadna的重组的重组质粒和菌种质粒和菌种l3.0 kbl1.2 kb重组体的鉴定：重组体的鉴定：利用限制性内切酶的切割来鉴定利用限制性内切酶的切割来鉴定质粒中是否有目的基因质粒中是否有目的基因dna69 指被克隆入某一载体中的目的基因，经转录指被克隆入某一载体中的目的基因，经转录和翻译

45、后产生和翻译后产生蛋白质蛋白质的过程。的过程。 核心是构建核心是构建合适的表达体系合适的表达体系： 表达载体的构建表达载体的构建 受体细胞的选择受体细胞的选择 表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化原核表达体系原核表达体系 ：原核基因，真核基因（：原核基因，真核基因（cdna）真核表达体系真核表达体系 ：真核基因：真核基因第四节第四节克隆基因的表达克隆基因的表达70e.colie.coli表达体系最为常用表达体系最为常用 标准：标准：选择标志选择标志 强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列 合理设计的多克隆位点合理设计的多克隆位点e.colie.coli表达体系的不足表达体系的不足 不宜表达

46、真核基因组不宜表达真核基因组dnadna（只能表达真核生物目的基因的（只能表达真核生物目的基因的cdna cdna ）不能加工表达真核蛋白质（缺转录后及翻译后加工）不能加工表达真核蛋白质（缺转录后及翻译后加工）表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body)(inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白一、原核生物表达体系一、原核生物表达体系71哺乳动物细胞的表达载体常由动物病毒改造哺乳动物细胞的表达载体常由动物病毒改造真核表达体系常用酵母、昆虫、哺乳类动物细胞真核表达体系常用酵母、昆虫、哺乳类动物细胞优点：优点：

47、可表达克隆的可表达克隆的cdnacdna及真核基因组及真核基因组dnadna 可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质 表达分泌型蛋白，有利于下游操作表达分泌型蛋白，有利于下游操作缺点：缺点：操作技术难、费时、不经济操作技术难、费时、不经济 （基因转移困难，整合位置和拷贝数难控制，表达（基因转移困难，整合位置和拷贝数难控制，表达 水平低）水平低）二、真核生物表达体系二、真核生物表达体系7273第五节第五节基因工程的下游技术基因工程的下游技术 基因工程菌的发酵培养：方式、参数、发酵罐基因工程菌的发酵培养：方式、参数、发酵罐 目的蛋白的分离纯化：难度最大目的蛋白的分离纯化：难度最大 目的蛋白的

48、分析鉴定：产品鉴定、浓度、纯度、活性目的蛋白的分析鉴定：产品鉴定、浓度、纯度、活性74第六节第六节基因工程技术的意义基因工程技术的意义一、促进对遗传信息的认识一、促进对遗传信息的认识人类基因组人类基因组dna约有约有2.85109bp，约，约2.5万个基因万个基因已知的人基因只占估计数已知的人基因只占估计数的百分之几的百分之几对表达调控了解很少对表达调控了解很少对非蛋白质偏码序列了解对非蛋白质偏码序列了解甚少甚少75dna重组技术重组技术76二、生产药物与疫苗二、生产药物与疫苗基因工程疫苗基因工程疫苗 使用使用dna重组生物技术，把天然的或人工合成的遗传物质重组生物技术，把天然的或人工合成的遗

49、传物质定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中，使之充分表达，经定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中，使之充分表达，经纯化后而制得的纯化后而制得的疫苗疫苗。 应用基因工程技术能制出不含感染性物质的亚单位疫苗、应用基因工程技术能制出不含感染性物质的亚单位疫苗、稳定的减毒疫苗及能预防多种疾病的稳定的减毒疫苗及能预防多种疾病的多价疫苗多价疫苗。如把编码乙型。如把编码乙型肝炎表面抗原的基因插入酵母菌基因组，制成肝炎表面抗原的基因插入酵母菌基因组，制成dna重组重组乙型肝乙型肝炎疫苗炎疫苗；把乙肝表面抗原、流感病毒血凝素、单纯疱疹病毒基；把乙肝表面抗原、流感病毒血凝素、单纯疱疹病毒基因插入牛痘苗基因组中制成

50、的多价疫苗等。因插入牛痘苗基因组中制成的多价疫苗等。 77 基因工程肽类药物基因工程肽类药物78基因工程抗体基因工程抗体79三、制造转基因动物和植物三、制造转基因动物和植物 在其基因组内稳定地在其基因组内稳定地整合外源基因并能遗传整合外源基因并能遗传给后代。给后代。遗传遗传育种育种建立人类疾病的建立人类疾病的动物模型动物模型治疗人类疾病的治疗人类疾病的蛋白蛋白提供健康的提供健康的器官器官转基因动物：转基因动物：19941994年能比普通西红柿保鲜时间更长的转基因西红柿投年能比普通西红柿保鲜时间更长的转基因西红柿投放市场放市场19961996年转基因玉米、转基因大豆相继投入商品生产年转基因玉米、

51、转基因大豆相继投入商品生产到到19961996年全世界已有年全世界已有250250万公顷土地种植转基因植物万公顷土地种植转基因植物 转基因植物：转基因植物： 抗植病、抗虫、抗病毒和抗除莠剂抗植病、抗虫、抗病毒和抗除莠剂 提高产量提高产量 改进质量改进质量81（一）疾病基因的发现（一）疾病基因的发现（二）发展生物制品（二）发展生物制品1 1、人类基因组计划人类基因组计划 human genome projecthuman genome project，hgphgp2 2、脆性、脆性x x综合症综合症1 1、蛋白质、蛋白质 epoepo、生长因子、胰岛素、生长因子、胰岛素、 干扰素、乙肝疫苗干扰素

52、、乙肝疫苗2 2、转基因食品、转基因食品3 3、生物克隆、生物克隆四、用于基因诊断与基因治疗（略）四、用于基因诊断与基因治疗（略）82（四）（四）基因治疗基因治疗 gene therapygene therapy（五）遗传病的预防（五）遗传病的预防（三）（三）dnadna诊断诊断 dna diagnosticsdna diagnostics1 1、基因芯片、基因芯片2 2、法医鉴定、法医鉴定3 3、亲子鉴定、亲子鉴定转基因转基因1 1、产前检查、产前检查2 2、疾病预测、疾病预测思考？思考？ 转基因植物有潜在的危险吗？如果有，可能在那几个方面？ 如何对转基因食品作安全性评估？ 如果有选择，你更愿意吃天然的植物还是转基因植物？ -84练习题练习题1、 限制性核酸内切酶切割限制性核酸内切酶切割dna后产生后产生a、5磷酸基和磷酸基和3羟基基团的末端羟基基团的末端b、5羟基基团和羟基基团和3磷酸基的末端磷酸基的末端c、5磷酸基和磷酸基和3磷酸基的末端磷酸基的末端d、5羟基基团和羟基基团和3羟基基团的末端羟基基团的末端e、以上都不是、以上都不是852、在下述双链、在下述双链d