离体培养液蔗糖浓度对水稻籽粒蔗糖合成酶活性的影响

1、离体培养液蔗糖浓度对水稻籽离体培养液蔗糖浓度对水稻籽粒蔗糖合成酶活性的影响粒蔗糖合成酶活性的影响植物学专题讨论之二植物学专题讨论之二导导 师：师： 粱建生粱建生 教授教授报告人：报告人： 王王 玉玉 霞霞 2005 年年12月月20日日前言 蔗糖合成酶的作用： 蔗糖+udp 果糖udpg1.材料与方法1.1供试材料 供试品种为具较高结实率的超级稻两优培九。2004年种植于扬州大学农学院试验田，单本植，田间管理一致，同一般大田栽培。始穗期选择生育进程和长势长相基本一致的主茎进行标记,待稻穗穗颈节露出剑叶鞘12,取样进行穗培养1.2水稻穗离体培养水稻穗离体培养 在无菌室中,先用体积分数为1%次氯酸

2、钠溶液对单茎穗穗颈节以下部分进行表面消毒,在无菌水中剪去距穗颈节1112以下部分,然后在超净工作台将单茎穗转移到盛有50培养液的玻璃管中,用无菌医用棉封口。每处理重复6次。无菌室用紫外线消毒,进入无菌室的器具、玻璃管、医用棉等都经高温高压或=70%酒精消毒。基本培养基成分包括ms无机盐和vb5有机成分，蔗糖浓度依试验处理定。培养玻璃管用铝箔包裹，在暗中培养，穗培室温度2425。 （1）不同浓度的蔗糖溶液处理0、50、100、150、200mm（2）不同时间的蔗糖溶液处理12、24、48h（3）不同渗透性溶液处理mit、sit、kcl100mm （4）相同浓度的己糖溶液处理glu、fru、glu

3、+fru 100mm（5）己糖激酶抑制剂处理nag （6）糖类似物溶液处理man、3-o-mg1.3试验处理试验处理2.试验方法试验方法2.1 蔗糖、可溶性总糖的测定2.2 蔗糖合成酶活性的测定10ml80%乙醇80c水浴30min冷却残渣10ml80%乙醇80c水浴30min2000rpm离心15min冷却2000rpm离心15min残渣10ml80%乙醇80c水浴30min冷却2000rpm离心15min残渣合并三次上清液0.1克干样定容至100ml蔗糖测定可溶性总糖测定吸0.9ml提取液吸1.0ml提取液0.1ml2n naoh1.0ml水沸水浴10min4ml0.2%蒽酮冷却15min

4、沸水浴1ml0.1%间苯二酚 3ml10n hcl80c水浴60min冷却比色od500冷却比色od620 酶的提取均在0-4低温下进行。取20粒-86冰箱贮存的籽粒，剥壳去胚后，籽粒加1.5ml提取介质快速研磨12,000rpm 离心15min，取上清夜作为粗酶液。 酶的提取介质为：100mmol/lhepes/koh (ph7.5), 5 mmol/lmgcl2, 5mmol/ldtt,20mmol/l巯基乙醇,10mmol/l抗坏血酸，2 mmol/ledta，1%(w/v)pvp。 酶的反应介质为：0.2ml 的反应介质中含有50mmol/l hepes/koh (ph7.5),5mm

5、ol/l mgcl2 ,3mmol/l udpg,15mmol/l 果糖，一定量的酶液。酶的活性测定过程参照roe（1934） 的方法，混合物30反应30分钟2mol/l naoh溶液终止反应，用间苯二酚测定生成的蔗糖的量。酶活力单位为mol蔗糖/mg蛋白分钟。 蛋白质含量测定：蛋白质的测定用bradford(1976)方法，以bsa为标准蛋白。1.不同浓度的蔗糖处理对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响不同浓度的蔗糖处理对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响sucrose content (mg.g-1 dw)20406080020406080soluble total sugar content (m

6、g.g-1 dw)050100150200feeding solution sucrose concentration (mm) feeding solution sucrose concentration (mm) 050100150200250sucrose synthase activity (mol.mg-1 pro.min-1).2.4.6.81.0由图可见，在介质蔗糖浓度为100mm范围内，蔗糖合成酶活性随蔗糖 浓度的提高而提高，当蔗糖浓度为150mm时略有下降，之后又再升高。fig.1.carbohydrate contents and susy activity in the

7、grains of rice .excised rice panicles were fed with solution containing the indicatedconcentrations of sucrose(0-200mm).2.不同时间的蔗糖处理对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响不同时间的蔗糖处理对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响sucrose content (mg.g-1dw)20406080100120h2o100mm sucrosetreatment period (h)soluble total sugar content (mg.g-1 dw)2040608010012

8、0244812treatment period (h)sucrose synthase activity (mol.mg-1 pro.min-1).2.4.6.8h2o100mm sucrose244812fig.2. carbohydrate contents and susy activity in the rice grains from excised rice panicles treated in h2o or in 100mm sucrose for 12,24,48h. 由图可见，蔗糖加入后促进了蔗糖合成酶活性的提高。这种效应在12小时时很明显，24小时达到峰值，之后开始下降。

9、3.不同渗透性糖对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响不同渗透性糖对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响table 1. effect of various osmotically activy sugars on susy activity in ricegrain from excised rice panicles that were cultured for 24h in water,sucrose,kcl, mannitol,or soribitol. 由表1看出，用kcl、甘露醇、山梨醇作为糖介质培养离体穗24小时，在百粒重、蔗糖含量、总糖含量及蔗糖合成酶活性与对照差异不大，这说明蔗糖对籽粒发

10、育以及蔗糖合成酶活性的调节不是因为渗透压的影响。4.己糖和抑制剂处理对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响己糖和抑制剂处理对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响nag: n-acetyl-glucosamine, an inhibitor of hexokinase(hxk); susy: sucrose synthasetable 2. effect of hexoses and nag on susy activity.in experiment a, excised rice panicles were fed water,100mmsucrose,100mm glucose,100mmfructo

11、se, or 100mmglucose plus 100mmfructose for 24h. in experiment b, excised rice panicles were fed water or 100mmsucrose ,glucose, fructose in the presence or absence of 10mmnag for 24h. 由表2可见，等摩尔浓度的己糖处理后蔗糖合成酶活性虽有提高，但这种效应要低于蔗糖对它的影响。模拟蔗糖水解的处理也没有达到蔗糖的促进效应。加入nag阻断己糖调节途径，对蔗糖的调节效应没有大的影响。这说明蔗糖调节是不依赖己糖激酶的途径。5

12、.己糖类似物处理对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响己糖类似物处理对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的影响table 3. sugar regulation of susy activity in the rice grains.excised rice panicles were fed with water,20mmsucrose,20mmglucose,20mmmannose and 20mm3-o-methylglucose(3-o-mg) in the dark for 24h.由表3可知，糖的类似物甘露糖，3氧甲基葡萄糖培养离体穗24小时，在百粒重、蔗糖含量、总糖含量及蔗糖合成酶活性与对照差异

13、不大。6.蔗糖对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的可逆调节蔗糖对水稻籽粒中蔗糖合成酶活性的可逆调节sucrose content (mg.g-1 dw)20406080100120treatment solutionh2osuch2o/sucsuc/h2osoluble total sugar content (mg.g-1 dw)020406080100120treatment solutionh2osuch2o/sucsuc/h2osucrose synthase activity (mol.mg-1 pro.min-1)0.0.2.4.6.8fig.3. sucrose-mediated cha

14、nges in susy activity were reversible.four excised rice panicles, and two of them were placed in water and the other two in 100mmsucrose.susy activity were measured from one panicles of each treatment after 24h.at the same time, the other two panicles were placed in the opposite treatment solution f

15、or another 24h. 由图3可见，蔗糖处理过的离体穗再放于水中24小时后可以解除蔗糖效应，同样水中培养的离体穗在蔗糖溶液中再处理24小时后能产生一样的蔗糖促进效应。这说明蔗糖对蔗糖合成酶活性的调节作用是可逆的。1.对蔗糖合成酶活性的调节主要是蔗糖的效应，且与外源蔗糖的浓度以及内源蔗糖含量都是相关的，2.蔗糖对蔗糖合成酶活性的调节是可逆的。3.蔗糖合成酶活性在一定浓度范围内与蔗糖浓度成正效应。4.外源蔗糖的加入会改变溶液的水势影响蔗糖的运输，为了消除渗透压的影响用相同摩尔浓度的渗透性糖处理证明蔗糖调节不是渗透压的影响。 由于植物中的蔗糖易水解成葡萄糖和果糖，所以对蔗糖特异的信号传导途径的解释较困难。然而，最近的实验表明，因植物存在蔗糖特异的信号传导途径从而影响基因的转录和翻译。例如，蔗糖特异地诱导patatin启动子基因转录首次证明蔗糖能特异地对蔗糖同向转运体的转录和翻译进行调节，而己糖等其他糖则不具备此调节作用。本实验也证明蔗糖合成酶活性是受蔗糖调节的。