野外采样实验

1、野外取样实验方案（201604）1. 实验目的研究自然条件下东南景天不同生育期间，其内生菌多样性的动态变化。2. 实验设计选择在东南景天的苗期、开花期、成熟期，于浙江衢州铅锌矿山采集具有代表性5个样点的超累积生态型东南景天，混合为一个样品并将其连同根际土壤放入无菌的塑料箱中，地上部裸露于袋外，保持鲜活状态，带回实验室，然后进行后续处理。3. 实验内容（1） powersoil试剂盒提取根际土壤菌DNA （2） 可培养植物内生菌分离（3） CTAB法提取植物内生菌DNA （4） 植物重金属含量测定（5） 土壤理化性质测定实验一 powersoil试剂盒提取根际土壤菌DNA1. 实验目的power

2、soil试剂盒提取根际土壤菌DNA，保存，待之后送检2. 实验步骤（1） 获取东南景天根际土壤小心把东南景天从土壤中取出，用镊子夹取粘附在根表的土壤。每个样点夹取约3g土壤，取1g立即提取DNA，余下装入封口袋，（？）-20保存。（取出的东南景天表面洗净，晾干。测量鲜重后，杀青，烘干。测量干重后，研磨，待测。植物重金属含量，3个重复，每个重复0.1g，共需要植物根茎叶鲜重各5g）（2）选取Mobio PowerSoil DNA Isolation Kit （MO BIO Laboratories, Inc, Carlsbad, CA）试剂盒提取土壤样品DNA。具体操作步骤如下：1）称取约0.2

3、5g土壤样品，放入研磨珠套管（PowerBead Tubes），涡旋混匀。2）套管中加入60l C1溶液（裂解缓冲液），颠倒数次，涡旋5s混匀。3）将套管放入水平涡旋振荡仪，在最大速度振荡10min。4）取出套管，在室温下10000g离心30s。5）把上清液（约400500l）转移到新的2mL离心管。6）加250l C2溶液（抑制物去除液）至离心管中，涡旋5s，4下放置5min，在室温下10000g离心1min。7）将上清液转移到另一新的2mL离心管，总体积不超过600l，同时避免吸出沉淀物。8）加200l C3溶液（抑制物去除液）至离心管中，涡旋混匀，4下放置5min，在室温下10000g离

4、心1min。9）将上清液转移到另一新的2mL离心管，总体积不超过750l，同时避免吸出沉淀物。10）加1.2mL C4溶液（高盐溶液）至离心管中，涡旋混匀，从离心管中抽取约650l溶液至离心过滤管（Spin Filter）。11）在室温下10000g离心1min，取出管中过滤柱，弃去液体，过滤柱放回管中。12）加入第10步离心管中约650l溶液，重复第步操作，加入第10步离心管中剩余的溶液，重复第11步操作。13）加500l C5溶液（乙醇淋洗缓冲液）至离心过滤管中，在室温下10000g离心30s，弃去管中液体。14）在室温下10000g离心1min。15）取出过滤柱小心放入新的2mL离心管中

5、，避免任何C5溶液溅到过滤柱上。16）加入60l C6溶液（DNA洗脱液）或无菌超纯水至过滤柱白色薄膜中，在室温下10000g离心30s。17）弃去离心柱，提取完成。分装-20保存，待下一步应用。实验二 可培养内生细菌的分离纯化保存1. 实验目的（1）分离东南景天内生菌，记录菌落数，菌落种类数，菌落形态，优势菌菌落数。（2）菌落纯化，保存菌种。2. 仪器和试剂2.1内生菌分离（1）需要干热灭菌的仪器培养皿150个（其中在15个培养皿中放入滤纸）150mL烧杯75个研砵15个（2） 需要高温湿热灭菌的仪器R2A 培养基3000mL，分装至15个250mL三角瓶磷酸缓冲溶液150mL，至于200m

6、L灭菌瓶试管+蒸馏水（2*3*5=30支试管）2000mL蒸馏水，装入1000mL三角瓶1mL枪头两盒（其中30个需要剪缺口）锡箔纸50张（3） 其他试剂99%酒精、35%双氧水、3%次氯酸钠2.2内生菌纯化保存（1）需要干热灭菌的仪器培养皿50个（2）需要高温湿热灭菌的仪器50%甘油150mL（约150个菌种用量），倒入200mL灭菌瓶。150个冻存管，用保鲜袋包装。R2A 固体培养基1000mL，分装至5个250mL三角瓶。R2A 液体培养基1000mL，分装至50个50mL三角瓶。3. 实验步骤3.1 植物样品表面（消毒灭菌烧杯：15个植物样5=75个）制作2000mL无菌水。分别取4g

7、植物样在自来水下冲洗99%酒精（1min）35%双氧水+3%次氯酸钠（30min）无菌水冲洗三次。取0.3g植物样用锡箔纸包装，做3个重复，液氮速冻，-80保存。3.2 可培养细菌的培养及纯化保存（1）细菌的培养基配方 R2A 培养基（1000ml蒸馏水，酵母粉0.5g、胰蛋白胨0.5g、酪蛋白氨基酸0.5g、葡萄糖0.5g、可溶性淀粉0.5g、KH2PO40.3g、MgSO47H2O：0.05g、丙酮酸钠0.2g，pH 7.2）配制R2A 培养基3000mL，分装至15个250mL三角瓶，高温湿热灭菌121,20min。（2）磷酸缓冲溶液（灭菌处理）磷酸缓冲溶液：0.8g氯化钠；0.02gK

8、H2PO4；0.11gNa2HPO4；0.02gKCl；100ml蒸馏水；PH值7.4。配制磷酸缓冲溶液150mL，至于200mL灭菌瓶，高温湿热灭菌121,20min。（3）研磨把消毒后的叶、茎和根，分别放在灭菌的研钵中，研磨成汁，加入3ml的磷酸缓冲溶液，搅拌均匀，静置10分钟，再搅拌。（4）稀释（2*3*5=30支试管）从研钵中取1ml的溶液分别稀释10倍、100倍（5）涂布分别从原液、10倍、100倍的溶液中取200微升到细菌的培养基上培养，每个梯度做3个平行。（用酒精浸泡，烧的时间长一些，叶、茎，考虑用不同的三角刮刀）（15个植物样*3个浓度*3个重复=135个平板）（6）平板培养一

9、星期后，计数，并记录其菌落形态。同时，根据菌落特征。 （7）菌种纯化保存（约50个菌种用量）配制50%甘油150mL（约150个菌种用量），倒入200mL灭菌瓶。准备150个冻存管，用保鲜袋包装。配制R2A 固体培养基1000mL，分装至5个250mL三角瓶，配制R2A 液体培养基1000mL，分装至50个50mL三角瓶。以上仪器试剂使用高温湿热灭菌121,20min。挑选不同的菌落到新的培养基，纯化1次。挑单个菌落到R2A液体培养基中，30 、160r/min，摇床12-16小时，摇到对数期或对数末期，测OD值，取700 uL菌液并加300 uL 50%甘油于甘油管中，保存，每个菌保存3个甘

10、油管。实验三 CTAB法提取植物内生菌DNA1. 实验目的利用CTAB法提取植物内生菌DNA，保存待测。2. 实验原理 十六烷基三甲基溴化铵 (hexadecyltrimethylammonium bromide, CTAB)是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。3. 实验材料（实验分3批完成）1） 液氮；2） 研钵6个，干热灭菌；3） CTAB DNA提取液： a. 100 mM

11、 Tris-HCl (pH8.0) 提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； b. 20 mM EDTA (pH8.0) 螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； c. 1.4 M NaCl提供一个高盐环境，使DNA蛋白复合物（DNP）充分溶解； d. 2 % (w/v) CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide) 溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； e. 1% PVP 40,000 (polyvinyl pyrrolidone) (聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，

12、有效去除多糖。 将上述试剂混合后，灭菌20分钟，常温保存；4） 酚氯仿异戊醇 按照酚:氯仿:异戊醇=48:48:4 的比例配置蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性；5) 氯仿异戊醇 按照氯仿:异戊醇=96:4 的比例配置。能克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹

13、量酚（酚易溶于氯仿中）；6) 异丙醇 沉淀DNA；7) 70%的酒精 清洗DNA；8) 2 mL与1.5 mL的离心管各18个，高温湿热灭菌。4. 实验步骤1） 收集大约100 mg的植物样品，在使用前保存于-80 。2） 将样品放于研钵中，配合液氮，快速将样品磨成粉末状，将粉末尽量收集于一个2 mL的离心管中。3） 将步骤2中的离心管中加入0.9 mL CTAB，漩涡震荡均匀，于65 中水浴20-30 分钟。4） 水浴后，加入0.9 mL氯仿异戊醇，上下翻转均匀，12000 rpm离心8分钟。5） 将离心后上清液（510L）转至另一干净的1.5 mL离心管中，加入340L（上清液体积的2/3

14、）异丙醇，上下翻转均匀（至有沉淀产生），12000 rpm离心8分钟。6） 离心后弃掉液体，用0.7 mL 70 %的酒精清洗，12000 rpm离心2分钟，小心地弃掉废液，防止将DNA倒出。7） 重复步骤6。8） 于通风橱中将酒精晾干，至透明状即可。9） 加入50 L灭菌水或TE水（pH8.0 TE可延长DNA保存时间），将DNA于-20 、-80 长期保存。5. 注意事项：1) 实验前应先预热水浴锅。3. 2) 在对DNA质量要求不是特别高的情况下，用氯仿异戊醇即可，不用酚氯仿异戊醇。实验四 植物重金属含量及土壤理化性质测定1. 实验目的回校后保存植物样及土壤，待后续检测。2. 实验步骤在获取根际土壤后，将取出的东南景天表面洗净，晾干。测量鲜重后，杀青，烘干。测量干重后，研磨，待测。植物重金属含量，3个重复，每个重复0.1g，共需要植物根茎叶鲜重各5g。内生菌分离试验后，取出土壤约100g，风干，研磨，过20目筛，