化验室操作规程

1、昌邑泰森活禽化验室操作规程（SOP）化验室管理规定1. 遵守化验室的各项规章制度，认真完成检测任务，对自己承担项目的检测结果负责；2. 严格按照本操作规程进行各项检测工作，确保检测数据的准确可靠；3. 填写检测原始记录，任务完成后及时进行数据处理，并进行校对和审核；4. 及时报告实验结果，并提出合理建议；5. 熟悉所用检测仪器设备的性能，严格执行操作规程，使用前后认真检查，并填写仪器设备使用情况记录表，负责所用仪器设备的保管、保养及自校工作，上报仪器设备的检定、维修计划；6. 化验人员进入化验室必须更换工作服，并在化验室不允许干与工作无关的事情，如吃东西、高声喧哗等；7. 每天下午下班前打扫化

2、验室卫生，每天完成实验后化验室用紫外线灯照射三十分钟。8. 密切配合领导安排的各项工作；9. 负责化验室的内务、卫生和安全；化验室主任的岗位职责与权限1职责与权限1.1 负责化验室日常检测工作的管理与协调；1.2 负责监督检查化验员的日常检测工作；1.3 负责培训考核化验员的日常工作与业务水平；1.4 负责发现和消除检测工作中存在的安全隐患；1.5 负责标准菌株、化学、生物制剂的管理；1.6 组织完成上级及场区领导安排的各项临时性工作；1.7 负责就检测项目的试验、检测。2. 知识与能力2.1具备丰富的家禽微生物检验专业知识及实践经验；2.2 具有一定的工作能力；2.3具有基本的管理及协调能力

3、。化验员的岗位职责与权限1. 岗位职责与权限1.1负责按照标准检测程序进行样品的制备与检测；1.2负责孵化场、养禽场环境、器具、设备、水样、空气等的微生物检测；1.3负责对养禽场血样、种蛋的检测；1.4及时、准确、详细的做好原始记录并出具、传递化验结果；1.5负责完成化验室的各项临时性工作；1.6配合协调场区的其他部门工作。2. 知识与能力2.1具备丰富的检验专业知识；2.2具有一定的工作能力；2.3具有对检测项目进行检测、分析、判断的能力。实验室玻璃器皿的洗涤程序1. 目的：确保实验室所用玻璃器皿的洁净，规范玻璃仪器的洗涤及存放。.2. 范围：实验室内使用的玻璃仪器。3. 程序：3.1 玻璃

4、仪器的洗涤3.1.1 常用洗涤液的配制和使用方法3.1.1.1 铬酸钾-浓硫酸溶液（100g/L）（洗液）：称取化学纯重铬酸钾100g 于烧杯中，加入100ml 水，微加热，使其溶解。把烧杯放于水盆中冷却后，慢慢加入化学纯硫酸，边加边用玻璃棒搅动，防止硫酸溅出，开始有沉淀析出，硫酸加到一定量沉淀可溶解，加硫酸至溶液总体积为1000ml。该洗液是强氧化剂，但氧化作用比较慢，直接接触器皿数分钟至数小时才有作用，取出后要用自来水充分冲洗7 次10 次，最后用纯水淋洗23 次。如果使用过久或受到强烈的还原性物质污染，以致整个液体变为绿色时，则其中绝大部分的高价铬盐已被还原成为低价的硫酸铬，此时洗涤液不

5、再具有氧化力，不宜再用。应集中进行处理，以回收铬。3.1.1.2 肥皂洗涤液、碱洗涤液、合成洗涤剂洗涤液：配制一定浓度，主要用于油脂和有机物的洗涤。3.1.1.3 氢氧化钾-乙醇洗涤液（100g/L）：取100g 氢氧化钾，用50ml 水溶解后，加工业乙醇至1L，它适用洗涤油垢、树脂等。3.1.1.4 盐酸乙醇溶液：1份盐酸和2份乙醇的混合物，用以洗涤有机试剂染色的器皿。3.1.2玻璃仪器的洗涤方法3.1.2.1 常规洗涤法：对于一般的的玻璃仪器，应先用自来水冲洗12 遍除尘后，如用强酸性氧化剂洗涤时，应将水沥干，以免过多地耗费洗液的氧化力。若用毛刷蘸取热肥皂液（洗涤剂或去污粉等）仔细刷净内外

6、表面，尤其应注意容器磨砂部分。然后边用水冲边刷洗至看不出肥皂液时，用自来水冲洗35 次，再用蒸馏水或去离子水充分冲洗23 次。洗净的清洁玻璃仪器上应不挂水珠。洗涤时应按少量多次的原则用水冲洗，每次充分振荡后倾倒干净。凡能用刷子刷洗的玻璃仪器，都应尽量用刷子蘸肥皂液进行洗刷，但不能用硬质刷子猛力擦洗容器内壁，因易使容器内壁毛糙，易吸附离子或其它杂质，影响测定结果或者难以清洗而造成污染。3.1.2.2 不便刷洗的的玻璃仪器的洗涤方法：可根据污垢的性质选择不同的洗涤液进行浸泡或共煮，再按常法用水冲净。3.2 玻璃仪器的干燥：将洗净的玻璃仪器倒置在滴水架上或专用柜内控水晾干。如急用时，可置于11012

7、0的清洁烘箱内烘烤1 小时左右。4玻璃仪器的保存：4.1 将干净的玻璃仪器倒置于专用柜内，关闭柜门防止落尘。4.2 凡有配套塞、盖的玻璃仪器都必须保持原装配套，不得拆散使用和存放。实验室常用无菌器皿的灭菌和管理1. 目的：提供无菌器皿的灭菌和管理方法。2灭菌方法：2.1玻璃器皿的包装和灭菌2.1.1玻璃器皿的包装磨口瓶：将清洗干净的磨口瓶瓶盖倒置于磨口瓶上，用一层报纸包装好再用线绳包扎。培养皿：将清洗干净直径为90mm的培养皿10个一包（直径为75mm的培养皿12个一包）用一层报纸包装或置于平皿专用灭菌桶内。吸管：将清洗干净的吸管用报纸单个缠绕包装。2.1.2将包装好的玻璃器皿做好标识置于12

8、1高压蒸汽灭菌15分钟。2.2 塑料制品的包装和灭菌将清洗干净的塑料制品装入适当的容器中，121高压蒸汽灭菌15分钟。2.3橡胶制品的包装和灭菌将清洗干净的橡胶制品装入适当的容器中，121高压蒸汽灭菌15分钟。2.4解剖器械及其他金属、陶瓷类用品的包装和灭菌 将解剖器械及其他金属、陶瓷类用品分别包扎或置入适当的容器中，121高压蒸汽灭菌15分钟。3. 管理方法：将包装好未灭菌或灭菌的玻璃器皿分别放入指定、有标识的区域，避免出现混拿、错拿现象。实验室培养基进货检验1. 目的：提供培养基进货检验的标准操作方法。2. 相关材料：待确认培养基、标准菌种（特定）、培养箱、已确认合格的培养基3. 操作规程

9、3.1每次进货后，先将干粉培养基放入待确认区域内，并作相应标识，严禁使用。3.2对于初次进货的干粉培养基，可直接用相关的菌种进行检测。3.3已确认合格并使用过的干粉培养基，按其使用说明配制后进行高压灭菌，待培养基冷却到50时，倾注平板待用。3.4把该培养基所检测的目标菌，按无菌操作转接到事先配制好的培养基上，根据该种菌株在该培养基的培养特性进行培养（一般37，2448h），观察标准菌种在培养基上生长是否良好，菌形、色泽、质地、大小是否符合该菌特征、颜色变化是否明显、生化试管培养基是否有产气、产酸等状态。3.5经检测确认目标菌种特征能够合格后，再次按3.4的方式用新进培养基与已确认合格并使用过的

10、干粉培养基作平行对比实验，观察其生长变化是否一致或相似。3.6确认合格后，将该种培养基转入待用区域，并作相应的标识。不合格的培养基，有质量负责人将信息反馈采购部门等候处理。实验室菌种的处理和保存1. 提供菌种的处理和保存标准操作方法。2. 相关材料：培养基、菌种、接种环、超净工作台、361培养箱、4冰箱3. 操作规程3.1菌种的处理3.1.1 无菌操作打开安甄瓶，用接种环挑取一环冻干菌，放入装有灭菌肉汤试管中，做好标示，置于361培养242h。3.1.2 将培养后的肉汤培养物接种于装有灭菌肉汤试管中，进行二代培养，置于361培养2 42h。3.1.3 依照3.1.2的模式对菌种进行3代、4代的

11、转接培养.3.2 短期保存3.2.1 将处理好的菌种肉汤培养物接种于琼脂斜面培养基上，做好标示，记清菌种名称及接种时间，在361培养242h。3.2.2 将斜面培养物用包装纸包好后，置于4冰箱内保存。3.2.3 每三个月对保存菌种进行复壮一次，同时检查菌种特性。3.2.4 菌种的复壮于特性检查3.2.4.1无菌操作将斜面培养物转接至已灭菌的装有肉汤的试管中，做好标示，置于361培养242h。3.2.4.2将肉汤培养物转接至已事先备好的琼脂斜面上，每支肉汤培养物接种三管斜面，做好标示，然后置于361培养242h。3.2.4.3取一管斜面培养物，根据该培养物的类别采用与培养物相对应的检测程序，对培

12、养物的特性进行检查并做好相应记录。3.3 长期保存3.3.1 将处理好的菌种肉汤培养物接种于半固体培养基上，做好标示，记清菌种名称及接种时间，在361培养242h。3.3.2将半固体培养物用包装纸包好后，置于4冰箱内保存。3.3.3每一年对保存菌种进行复壮一次，同时检查菌种特性，检查方法同3.2.4.3进行。3.4对存放菌种的冰箱每周进行检查一次，并将检查情况做好记录细菌抹片、制备及染色1目的：观察细菌形态结构及鉴别的操作方法2相关材料：玻片、5石炭酸液、龙胆紫粉末、碘片、碘化钾、95酒精、碱性复红粉末、美兰、0.01%氢氧化钾溶液、瑞氏染色剂粉、白甘油、中性甲醇、姬姆萨氏染色剂粉末、甲醇、显

13、微镜、试管架、酒精灯、接种环、药匙、称量纸、电子称、待试菌、灭菌蒸馏水、吸水纸、香柏油3细菌抹片的制备3.1 玻片准备：载玻片应清晰透明，洁净而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好。如有残余油迹，可按下列方法处理：3.1.1 滴上95酒精23滴，用洁净纱布揩擦，然后在酒精灯上轻轻脱过几次。3.1.2若上述方法未能去除油渍可再滴12滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯上轻轻通过。3.2抹片：所用材料不同，抹片方法亦有差异3.2.1液体材料（如液体培养物、血液、渗出液、乳液）可直接用灭菌接种环取一环材料与玻片的中央均匀涂成适当大小的薄层。3.2.2不是液体材料（如菌落、脓、粪便等）则应先用灭菌接种环

14、取少量生理盐水或蒸馏水，置与玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。3.2 .3 组织脏器材料，先用镊子夹持局部，然后以灭菌或洁净剪刀取一小块，夹出后将其新鲜切面在玻片上压印或涂成一薄片。3.2.4 如有多个样品同时须要制成抹片，只要染色方法相同，亦可以在同一张玻片上有序的排好，做多点涂抹，或者先用蜡笔在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品，需要保留的样本片，应贴好标签，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。3.2.5 上述涂片应让其自然干燥。3.2.6 固定：有两类固定方法 3.2.6.1火焰固定：将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯上

15、来回通过数次，略作加热（但不能太热，以不烫手背为度）进行固定。3.2.6.2 化学固定：血液、组织、脏器等抹片要作吉姆萨染色时，不用火焰固定，而应用甲醇固定，可将已干燥的抹片侵入甲醇中23分钟，取出晾干：或在玻片上滴加数滴甲醇使其作用23分钟后，自然挥发干燥，抹片如作瑞氏染色，则不必先作固定。染料中含有甲醇，可以达到固定的目的。4常用的染色方法及 染色液的配制与操作： 4.1 美兰染色液：美兰0.3g、95%乙醇30ml、0.01%氢氧化钾溶液100ml.将美兰溶解与乙醇中，然后与氢氧化钾溶液混合。4.1.4 染色法：抹片在火焰固定后，加染液于玻片上，染色35分钟。水洗、吸干、镜检。4.2 瑞

16、氏染色液：瑞氏染色剂粉0.1g、白甘油1.0ml、中性甲醇60ml，置染料于一个干净的乳钵中，加甘油研磨至完全细末，再加入甲醇使其溶解，溶解后盛于棕色瓶中一星期，过滤于中性的棕色瓶中，保存于暗处，该染色剂保存时间愈久，染色的色泽愈鲜。4.2.1 染色法：涂片任其自然干燥;加染色液约1ml于涂片上，染色1分钟，使标本被染色液中甲醇所固定 ：再加上与染色液等量的磷酸盐缓冲液或蒸馏水（或自来水）用口吹气，使染色液与蒸馏水充分混合，并防止染料的沉淀，经5分钟左右，使表面显金属的闪光；冲洗、洗干、镜检。 注：磷酸二氢钾缓冲液：磷酸二氢钾6.63g、无水磷酸钠2.56g、蒸馏水100ml。4.3 姬姆萨氏

17、染色液：取姬姆萨氏染色剂粉末0.6g,，加入甘油50ml，置于5560温度中1.52小时后，加入甲醇50ml，静置一日以上，过滤后即可应用。4.3.1 染色法：加姬姆萨氏染色液10滴于10ml蒸馏水中，配成稀释的溶液，所用蒸馏水必须是中性或微碱性（必要时加1%碳酸钠液一滴于水中，使其变为微碱性）；抹片任其自然干燥，浸入盛有染色液的染色缸中，染色30分钟或者染色数小时，过夜亦可；水洗、洗干、镜检。4.4 革兰氏染液的配制：4.4.1龙胆紫原液：龙胆紫粉末5g，加95酒精100ml。4.4.2石炭酸龙胆紫液：龙胆紫原液10ml、5石炭酸液90ml混合，虑过后备用。4.4.3.碘溶液（鲁格氏液）：碘

18、片1g、碘化钾2g、蒸馏水300ml 先将碘化钾2g加水30ml使其溶解，再将研碎的碘片1g加入，完全溶解后再加足量的蒸馏水，使全量为300ml。4.4.4脱色液：95%酒精4.4.5稀释复红：碱性复红原液：碱性复红粉末10g，加95酒精100ml。石炭酸复红液：碱性复红原液10ml, 5石炭酸液90ml混合,放置过夜后虑过，储褐色瓶中备用。稀释石炭酸复红液：石炭酸复红液10ml、蒸馏水90ml混合后，即为稀释复红。4.4.6 革兰氏染色法4.4.6.1在已干燥固定好的抹片上，滴加龙胆紫染色液，经12分钟，水洗。4.4.6.2加革兰氏碘溶液于抹片上媒染，作用13分钟，水洗。4.4.6.3加95

19、酒精于抹片上脱色，约30秒1分钟，水洗。4.4.6.4加稀释碳酸复红1030秒钟，水洗。4.4.6.5吸干、镜检。观察细菌大小、形态和颜色（革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色）备注：在进行各种染色时都应注意，当抹片滴上染色液后，不可直接将剩余染液倾去，应用水连染液一起充分洗去，然后进行下一步骤，以免发生沉渣黏附，影响染色效果。实验室菌落总数检测1 目的：提供平板菌落计数的标准检测方法2相关材料：2.1仪器设备：恒温培养箱361，吸头（100微升）微量移液器，直径为90毫米的培养皿,试管架2.2培养基和试剂：平板计数琼脂，9生理盐水，75酒精棉球3操作规程3.1 将采集到的样品逐一编号、登记

20、，不能及时检测的放置于-4冰箱保存不得超过3小时。3.2 超净工作台用紫外灯照射三十分钟后方可使用。3.3 检测时先用75酒精棉球擦拭双手。3.4 每个样品液混匀后用微量移液器吸取100微升注于灭菌培养皿内，做好标识。每个样更换一次吸头，避免交叉污染。3.5 对于污染严重的样品，作好倍比稀释后在移入平皿。3.6 同时做空白对照，3.7移夜完毕后把45-50的平板计数琼脂倾注于灭菌培养皿内，每皿约1215ml，在水平面上，顺时针、逆时针各轻轻旋转混匀培养皿3圈，避免培养基溅于皿盖上。每个样品从开始做到结束，时间不得超过20min。3.8 待培养基完全凝固后，翻转平皿，置于361培养箱内，培养24

21、h。3.9 培养后，立即计数每个平板上的菌落数，25250个菌落为合适范围。如果不能立即计数，应将平皿存放于04，但不能超过24h。3.10 若平板上出现链状菌落且菌落之间没有明显界限，每一条链作为一个菌落计，不能把链上生长的各个菌落分开来数。3.11 若平板上菌落密布，可选取平板的1/4或1/8计数3.12 计数和报告：将所数得的菌落个数乘以相应的稀释倍数。固体以克为单位，液体以毫升为单位。表面涂擦液以平方厘米为单位，消毒后种蛋以3.5cm规板计。3.13 查阅相关的限定标准，给出检测样品客观评价。细菌对抗菌药物的敏感试验1目的：提供细菌对抗菌药物的敏感试验的标准采集与操作方法。2相关材料：

22、无菌剪刀、无菌搪瓷盘、消毒剂、无菌容器(平皿、磨口瓶、包装袋)、酒精灯、接种环、打火机、75%酒精棉球、一次性手套、普通营养琼脂培养基或特殊培养基、药敏纸片(购买或自制)、待测病料、无菌眼科镊、无菌试管、试管架、试管塞、记号笔、2ml或5ml一次性注射器、超净工作台、371恒温培养箱、带刻度直尺3操作步骤：样品的采集可由部门委托本室人员采集、也可由部门送检。3.1要求待检病料新鲜、无污染。3.2采样方法：首先将病、死禽放在盛有消毒液的瓷盆中浸泡5分钟，以去除禽体表面杂菌。让其仰卧，然后用无菌剪刀剥离皮肤，再打开体腔，剖开腹腔后，注意不能损坏肠道。再用另一把无菌剪刀灼烧后烫烙需采集脏器表面，并在

23、烧烙部位刺一孔，然后用经酒精灯灼烧的的铂金接种环的铂耳伸入孔内，取少量组织或液体，以无菌操作划线接种于普通营养琼脂或特殊培养基上，做好标记，按临床判断标准进行有氧或无氧培养18-24h（371）后拿出备用。3.3采样数量：以饲养场为单位，合为一个样检测。3.4样品的标识：要求有样品来源样品名称、样品数量、样品编号、抽样日期、检测项目等内容。3.5样品的送检：要求所采集的样品以最快最直接的途径送往化验室。4操作规程：4.1待测病料的分离培养：4.1.1在无菌操作条件下，将待测病料（含有典型临床症状部分）用平板划线分离法接种于普通营养琼脂培养基或特殊培养基上（血琼脂、ss琼脂、麦康凯琼脂），于37

24、1恒温培养箱中培养18-24h后备用。4.1.2用灼烧过的接种环以无菌操作从普通营养琼脂培养基或特殊培养基蘸取单个典型的菌落一环接种于肉汤培养管中，于371恒温培养箱培养6h后，4保存备用。4.2操作步骤：4.2.1将培养6h后的肉汤培养物充分摇匀，用灭菌的棉棒蘸取少量菌液在普通营养琼脂或者特殊培养表面均匀涂布。4.2.2用无菌眼科镊，镊取各种购买或自制的药敏纸片，分别贴于中培养基表面，并用镊子轻按纸片使药敏纸片与培养基表面密贴；药敏纸片应在培养基表面均匀分布，一般可按培养基中央贴一种纸片，外周以等距离贴若干种纸片，这样一个（直径90mm）平板可贴8个药敏纸片；同时在纸片与培养皿底部相应的位置

25、作好标记；最后将贴好纸片的平板倒置放置于371恒温箱中培养18-24h后，取出观察结果。4.2.3结果观察：凡对待测细菌有抑制能力的药敏纸片，在其周围会出现一个无菌生长的圆圈，称为抑菌圈。可用带刻度直尺测量抑菌圈的大小，抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感度越大，反之越小，则说明该菌对此药具有耐药性。5结果判定：判定结果时，应按抑菌圈直径大小（以mm为计量单位）作为判定敏感度高低的标准，具体的判定标准见下表：表1. 药敏试验判定标准抑菌直径（mm）敏感度20以上极敏15-20高敏10-14中敏10以下低敏0不敏6记录与报告：操作过程中做好记录，根据检测结果填写报告单，由相关责任人签名，及时传递到相关

26、部门。药物最佳抑菌浓度的选择1目的：提供药物最佳抑菌浓度选择的标准操作方法2相关材料：试管、试管塞、试管架、培养皿、酒精灯、01000ul移液器、接种环、1ml吸头、药匙、称量纸、万分之一天平、超净工作台、371恒温培养箱、营养肉汤、营养琼脂、琼脂糖、待试菌、抗菌药、灭菌蒸馏水3操作规程3.1 试剂的制备：3.1.1不同浓度药液的制备：将准确称量的不同剂量抗生素溶于等量的灭菌蒸馏水中，稀释成所需的浓度。3.1.2不同浓度药液培养基的制备：用移液器取3.1.1中不同浓度的药液1ml以无菌操作注入无菌的空培养皿内，然后倾注融化并冷却至45的定量琼脂，随即用手掌搓转振荡混匀，待琼脂凝固后，倒转放置4

27、-8冰箱内备用。3.1.3待测细菌的分离与保存：将待检病料用平板划线分离法培养18-24h得到的单个菌落以无菌操作接种于营养琼脂斜面上（内含4琼脂粉），于4-8冰箱中保存。3.1.4待测细菌悬液的制备：用灼烧过的接种环以无菌操作从营养琼脂斜面上蘸取适量被测菌接种于肉汤培养管中，371温培养箱培养6h。3.2 操作步骤：3.2.1将不同浓度药液培养基平板从冰箱中取出，放置371恒温培养箱中数分钟以蒸发掉培养基表面的凝结水。3.2.2按3.1.4制备好待测细菌悬液，置371温培养箱培养6h后，连同3.1.2中平板放于洁净工作台。3.2.3在无菌条件下，用接种环取一环待测菌悬液接种于不同浓度药液培养

28、基平板上（采用平板划线分离培养法）。3.2.4划线完毕，灼烧接种环，将培养皿倒转放置于371恒温培养箱中培养18-24h后观察。4结果判定:不同药液浓度平板在恒温培养箱中培养24h后，观察结果。凡平板中无细菌生长者，该平板所含的药液浓度为最低抑菌浓度（MIC）。一般以最低抑菌浓度作为细菌对药物的敏感浓度。5记录与报告：操作过程中做好记录，根据检测结果填写报告单，由相关责任人签名，及时传递到相关部门。消毒剂消毒效果的检测（方法一）1. 目的：提供检测消毒剂消毒效果的标准操作方法2. 相关材料：试管、试管塞、试管架、培养皿、酒精灯、01000ul移液器、接种环、1ml吸头、药匙、称量纸、万分之一天

29、平、超净工作台、371恒温培养箱、营养肉汤、营养琼脂、待试菌、消毒剂、灭菌蒸馏水3. 操作规程3.1 取一个地方菌，在超净台中用灭菌接种环接种于营养肉汤中，于37培养24小时；3.2 把需要检测的消毒剂分别按不同浓度依次稀释好，置于灭菌试管中待用；3.3 分别吸取20微升菌液（根据菌液浑浊度，菌多浑浊就加20微升，菌少就加50微升）放入灭菌平皿中，换枪头后再分别吸取100微升3.2中不同浓度的消毒液依次放入不同的平皿中，在桌面上轻轻晃动，混合均匀，作上标记，室温下反应30分钟。3.4 在上述3.3平皿中依次倒入约45-50的营养琼脂，在桌面上轻轻晃动，凝固后于37恒温箱内培养24小时，计细菌总

30、数。3.5 结果判定：根据细菌总数的多少来判定消毒剂的消毒效果。再结合生产实际和消毒剂的价格及稀释配比，来选择最合适的消毒剂。消毒剂消毒效果的检测（方法二）1、 目的：提供检测消毒剂消毒效果的标准操作方法2、 相关材料：试管、试管塞、试管架、三角瓶培养皿、酒精灯、01000ul移液器、接种环、1ml吸头、药匙、称量纸、万分之一天平、超净工作台、371恒温培养箱、营养肉汤、营养琼脂、待试菌、消毒剂、灭菌蒸馏水3、 操作规程3.1将从孵化场和商品鸡场分离到的菌株分别接种于营养肉汤，置于37恒温箱培养612小时，连续传代2次，备用；3.2将试管、刻度吸管、平皿等灭菌，备用；3.3将灭菌后的营养肉汤分

31、装成4.5mL/管，置37恒温箱培养24h，备用；3.4将被检测的消毒剂，按照各消毒剂推荐使用浓度进行稀释备用。3.5分别取上述各浓度的消毒剂0.5mL，加入到4.5mL营养肉汤中，混匀。3.6分别取从养殖场和孵化场分离的菌株复壮培养液0.025mL，分别加入到被测消毒剂的各稀释浓度的肉汤培养基中，置37恒温箱培养24h，同时设细菌阳性对照和空白阴性对照，观察并记录结果；3.7用接种环分别取各被测消毒剂肉汤培养液，接种于普通营养琼脂上，置37恒温箱培养24h，观察并记录结果。4、结果判定：4.1观察肉汤培养基的混浊度，有细菌生长时，可见肉汤混浊，用“”表示；无细菌生长时，肉汤清晰透明，与空白阴

32、性对照一致，用“”表示。4.2在普通营养琼脂培养基中有细菌生长时，用“”表示；无细菌生长时，用“”表示。5、实验结果分析5.1对实验菌株敏感性由高到低的消毒剂分别是：5.2假如养殖场用水稀释，同样配制1吨消毒剂（即1000L），这时所需要花费的消毒剂成本分别为：消毒剂成本由低到高分别为：球虫卵囊的检测1目的/目标：提供球虫卵囊的检测操作方法。2相关材料： 饱和盐水 电子称 150毫升三角瓶 红细胞计数器 显微镜 载盖玻片 移液枪 吸头（剪掉尖头）3操作步骤：3.1 将4克鸡粪加到56毫升饱和盐水中混合摇匀静置3.2 调试显微镜3.3 将准备好洁净血球计数板盖上盖玻片一块3.4 用灭菌吸头吸取一

33、小滴稀释液（不宜过多）滴入片子的一侧，让菌液自行进入计数室也可用吸水纸从另一侧吸过一般计数室便可以充满，注意不要产生气泡。3.5 放入载物台，先用低倍镜找到视野，再用400倍进行计数。3.6 找到视野后从25个中方格选5个进行计数（可选4个角和中间）3.7 位于格线菌体一般只数上方和右边线上的算出5个方格的总数3.8 一毫升中球虫的含量计算公式： A/52515A为5个中方格球虫总数4 检测标准：每克粪便中球虫含量不得超过3000。鸡白痢平板凝集试验1目的：提供鸡白痢（或鸡伤寒）平板凝集试验的标准操作方法2相关材料：鸡白痢鸡伤寒多价平板凝集抗原、鸡白痢强阳性血清、鸡白痢弱阳性血清、鸡白痢阴性血

34、清、待检血样、玻璃板、针头、离心机、酒精灯、火机、酒精棉、微量移液器、吸头等3操作步骤：3.1操作方法取一块洁净的玻璃板，用酒精棉擦拭后，点火燃尽在玻璃表面的酒精。在20-25环境条件下用定量移液器吸取血清30ul滴加在洁净的玻璃板上，然后用微量移液器取30ul抗原与血清充分混合均匀，并使混合液散开至直径约2cm时不断摇动玻璃板，计时在2分钟内判定结果。同时设阳性血清、弱阳性血清、阴性血清对照。3.2结果判定3.2.1判定标准如下100%凝集（+）：紫色凝集块大而明显，混合液稍浑浊。75%凝集（+）：紫色凝集块较明显，混合液有轻度浑浊。50%凝集（+）：出现明显的染色颗粒，混合液较浑浊。25%

35、凝集（+）：仅出现少量颗粒，混合液浑浊。 0%（）：无凝集颗粒出现，混合液浑浊。3.2.2在2分钟内抗原与强阳性血清混合后应呈100%凝集（+）、与弱阳性血清混合后应呈50%凝集（+）、与阴性血清混合后不凝集（）判试验有效。3.2.3在2分钟内被检血清与抗原之间出现50%（+）以上凝集者为阳性，不发生凝集的则为阴性。介于两者之间的为可疑反应（50%0%）此时应该将该鸡隔离饲养，一个月后再做检测，若仍为可疑反应，按阳性反应判定。4记录与报告：操作过程中做好记录，根据检测结果填写报告单。分析实验结果，注意沙门氏菌污染动态变化趋势，即时判断鸡场沙门氏菌污染情况。由相关责任人签名，及时传递到相关部门。

36、养禽场鸡舍环境、设备、器具表面及空气样品的采集与检测1目的：提供鸡舍环境、设备、器具表面及空气样品采集与检测的标准操作方法2相关材料：装10m l灭菌生理盐水的灭菌试管、灭菌棉签、酒精灯、规板（102）、打火机、试管架、75%酒精棉球、记号笔、泡沫箱、剪刀、平板计数琼脂、90培养皿。3. 环境、设备、器具表面及空气样品采集的方法3.1 环境、设备、器具表面样品的采集3.11两名化验员以生产区工人入场程序进入鸡舍。用75%酒精棉球擦拭双手。3.1.2 打开包装生理盐水试管，摆设与试管架架上，一人在酒精灯上灼烧规板后，放于待测物表面。3.1.3 另一人拿出一支试管，取出一支棉签在靠近酒精灯处打开试

37、管塞，用灭菌棉签蘸取少量生理盐水，盖好管塞，上下左右擦拭规板内面积2遍后，打开管塞将棉签在管口处用剪刀剪断，塞好塞子做好标识。3.1.4 采下一个样时再次灼烧规板，更换试管。3.1.5 鸡舍地面采样时，须选取鸡舍五点（四个角及中央）是样品具有代表性32 空气的采样法将检查合格的倒有平板计数琼脂的90培养皿带入待测鸡舍，在鸡舍四个角及中央选取58个点各放置一套培养皿。打开皿盖开始计时，15分钟后盖上皿盖，带回化验室置于361培养24h计数。表3.养鸡场微生物检测标准参考数据分级平板上菌数（进鸡前）平板上菌数（正常养鸡时）评价1060 0600优良2611006001000安全3101140100

38、01400注意通风414120014002000需消毒5201以上2000以上禁止进鸡表4. 设备、器具表面微生物检测标准（菌数/2）分级平板上菌数评价10-18干 净219-36轻度污染337-54中度污染454以上高度污染养禽场水样的采集与检测1. 目的：提供水样采集与检测的标准操作方法2. 相关材料：灭菌试管15150 、灭菌棉签、打火机、试管架、记号笔3. 操作步骤：3.1 洗净双手并消毒3.2 把灭菌试管打开包装纸，摆于试管架上3.3 用打火机灼烧待测水笼头，以杀灭管口的微生物。拧开水笼头，让水流35分钟。3.4 打开灭菌试管的塞子，接取10ml左右水，塞好塞子，立即带回化验室检测，

39、不能立即检测的，保存于4摄氏度冰箱中。3.5 取井水、池水、河水等地面水样时，须用特制的取样器，距水面10-15厘米深处取水。3.6 取鸡舌饮水器和水槽中的水样时，关闭水源，使水静置30分钟，用灭菌的吸管吸取水样放入灭菌的玻璃瓶中备用。3.7 取水样检查前，应将水样充分振摇25次。3.8 检测方法同环境、设备表面微生物检测方法。表5. 家禽饮用水微生物学标准级别评价细菌总数/毫升大肠杆菌数/毫升优纯水0-100良可饮用水10-1000中尚可饮用水1000-1000010-50差污水10000以上100消毒前后种蛋表面、孵化厅及孵化器内空气采样及检测1目的：提供消毒前后种蛋表面、孵化厅及孵化器内

40、空气微生物检测的标准操作方法。2相关材料：2.1 种蛋表面微生物检测所需材料被测试种蛋、普通琼脂培养基、平板计数培养基、.灭菌培养皿、灭菌15150mm试管、0.9%灭菌生理盐水、剪刀、酒精棉球、记号笔、灭菌的1000ul吸头、01000ul移液器、灭菌棉棒、内径为3.5cm的规板、371恒温培养箱2.2 孵化厅及孵化器内空气微生物检测所需材料平板计数培养基、灭菌培养皿、计时器、包装纸、371恒温培养箱3操作方法：样品的采集应由本室检测员采集。3.1种蛋表面微生物检测样品采集与检测步骤：3.1.1将被测种蛋夹在直径为3.5cm的规板内,大头朝上。3.1.2在装有5mL灭菌生理盐水的试管中浸湿灭

41、菌的棉棒，在试管壁上挤去多余的生理盐水，然后在规板范围内滚动棉棒涂抹蛋壳表面取样。3.1.3在试管口用剪刀剪断棉棒的手持端，使取样端落入试管中，盖好试管塞，放置于试管架上，做好标记带回化验室检测。3.1.4无菌条件下反复晃动试管，以充分洗涤下棉棒上的细菌。3.1.5用01000ul微量移液器吸取1000ul细菌悬液，注入灭菌的空培养皿内，然后倾注熔化并冷却到45-50的营养琼脂，充分摇匀混合。3.1.6待营养琼脂凝固后，倒转培养皿，置371恒温培养箱中培养24小时后，准确计数出培养皿内的菌落数。3.1.7根据培养皿内的菌落数和菌液的稀释倍数计算出取样范围内的细菌总数。规板内细菌总数=培养皿内的

42、菌落数稀释倍数3.2孵化厅及孵化器内空气微生物检测操作步骤：3.2.1将灭菌并冷却至45-50的琼脂倒入灭菌培养皿内，待凝固后，放置于371恒温培养箱中培养18-24小时后观察无细菌生长者，备用。3.2.2将无细菌生长培养皿在孵化厅或孵化器内暴露10分钟，然后盖上培养皿盖，用包装纸包好并作上标记带回化验室。3.2.3将3.2.2中培养皿置371恒温培养箱中倒置培养24小时后，计算培养皿内的菌落数。3.2.4每台孵化厅或孵化器，取样4-8个，求其平均菌落数。4 检测标准：4.1消毒前后种蛋表面微生物检测标准如下：表6. 未消毒种蛋微生物检测标准分级种蛋评价蛋壳表面总菌数规板（3.5cm）内菌数1

43、干净蛋3200以下600以下2脏蛋40003000076057003极脏蛋400000以上76000以上表7.消毒后种蛋微生物检测标准 分级消毒率（%）蛋壳表面总菌数规板（3.5cm）内菌数优100900320060良898032164061120中7970641960121180差69以下961以上181以上4.2孵化厅及孵化器内空气微生物检测标准如下表：表8. 孵化器、孵化室微生物检测标准（空气暴露10分钟）分级评价孵化器菌落数孵化室菌落数1优0100152良112516363中264637574差476658765劣678677966糟87以上97以上表9. 采用四级分类平板空气暴露法级

44、 别评 价平板上平均总菌落数1干净0-102轻度污染11-203中度污染21-304高度污染30以上5 记录与报告操作过程中做好记录，根据检测结果填写报告单，由相关责任人签名，及时传递到相关部门。出雏器中绒毛样品的采集与检测1 目的：提供出雏器中绒毛微生物检测的标准操作方法2 相关材料：灭菌镊子，灭菌培养皿，（90毫米），灭菌吸头，三角瓶、灭菌蒸馏水、记号笔、平板计数琼脂、灭菌称量纸、移液器3 操作步骤31在出雏接近完成时，用无菌镊子刮取出雏器中的绒毛，每台出雏器测2份绒毛，置于灭菌培养皿中，带回化验室。32用灭菌称量纸称取0.25克绒毛放入盛有100毫升灭菌蒸馏水的三角瓶中充分摇动，使绒毛浸

45、湿但不要粘到三角瓶壁上。3.3使混合液静置30分钟。3.4无菌吸取混合液1mL注入灭菌平皿内，将451的平板计数琼脂培养基倾入培养皿内，正反时针各轻轻摇三圈，混匀。3.5待琼脂凝固后，反转平皿，置于361培养24h计数。3.6平板上所得的菌数乘以400即为每克绒毛中所含菌数。表10. 出雏器熏蒸前后绒毛微生物检测标准（菌数/g）级别熏前菌数熏后菌数优7500025000300000100000差300000以上100000以上禽血液样本的采集1. 目的：提供采集禽（以鸡为例）血液样本的标准方法，适用于血凝血抑试验、平板凝集试验、琼脂扩散试验。2相关材料：2ml或5ml

46、一次性注射器、1.5ml无菌离心管、75%酒精棉球、离心管架、保温箱或泡沫箱、冰块、记号笔3操作步骤：样品的采集可由部门委托本室人员采集、也可由部门送检。3.1血样采集方法：3.1.1 方法一：心脏采血法（可单人或双人操作） 以龙骨突为准的定位方法进行心脏采血。助手左手握鸡的两腿向后拉,右手按住体部,右侧卧保定在小凳或地面上。鸡体矢状面与地平行,背侧向助手,腹侧向术者。确定部位以龙骨突为准,距4厘米处划一与背平行的线,再由龙骨突向后2厘米处划尸垂直线,交点即是进针处。以手指按压稍有凹陷(龙骨间隙),触之心动明显。操作时左手拇指抵于龙骨突上,其余四指轻轻向_L向背侧分开心区周围羽毛,拔除细绒毛,

47、再用左手食指稍向背部推压皮肤,绷紧固定,酒精消毒,右手持注射器采血。使用7号针头,避开皮下血管,由进针处垂直小心刺入,当触及心脏时即有搏动感,再继续进针0.30.4厘米即有回血,若无回血再稍进针或提针,同时抽动活宋,便可见回血,固定针头抽至需要量。切不可乱刺。日龄较小雏鸡多采用此方法进行血样采集。3.1.2 方法二：固定鸡后，展开翅膀在翅下选一条粗大静脉，用75%酒精棉球消毒，待干燥后以指压迫静脉的回心端，使静脉努张，然后用1ml或5ml一次性注射器针头刺入血管，发现血液回流时抽取血液，一般抽取0.6-1.0ml；然后缓慢注入1.5ml无菌离心管中，置于离心管架上做好标记。在室温下静置待血液凝

48、固，（或有血清自然析出时）填写抽样单连同血样一起送往化验室。日龄较大的鸡只多采用此方法进行血样采集。3.2采样位点：如在鸡场采样，注意选取鸡舍的不同位置；每个饲养群随机取样，并使样品具有代表性。3.3样品标识：要求有样品来源、样品名称、样品数量、样品编号、抽样日期、检测项目等内容。3.4样品送检：要求所采集的样品以最快最直接的途径送往化验室。如果样品能在采集后4小时内送抵化验室，则可在常温下送检；若24小时内送抵化验室应放在保温箱中加冰块冷藏送检，若超过24小时要先将样品血清吸出并冷冻，在保温箱内加大量冰块运输，途中不能超过48小时，以防止影响检测结果禽流感（法氏囊）琼脂凝胶免疫扩散试验1目的

49、：提供禽流感琼脂凝胶免疫扩散试验检验的标准操作方法2相关材料：禽流感琼扩抗原、禽流感琼扩阳性血清、磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、氯化钠（分析纯）、琼脂糖、打孔器 、培养皿、烧杯、玻璃棒、水浴锅、冰箱、酒精灯、针头、被检血清、脱脂棉、微量移液器、吸头、量筒、恒温培养箱、氢氧化钠、10ml刻度吸管、蒸馏水3试剂的制备：3.1 pH6.4、0.01mol/LPBS的配制：甲液： Na2HPO412H2O 3.58g 加蒸馏水至1000ml；乙液： KH2PO4 1.36g 加蒸馏水至1000ml；待甲乙二液充分溶解后，分别保存，用时取甲液24ml，乙液76ml

50、混合即可。 灭菌或过滤，PBS一经使用，于4保存不超过3周。3.2 琼脂板的制备：称量琼脂糖0.8g，加入100ml的pH6.4、0.01mol/LPBS中，在水浴中煮沸充分融化，加入8.0g氯化钠（NaCl），充分溶解后加入1%硫柳汞溶液1ml，冷至4550时，将洁净干热灭菌直径90mm来皿置于平台上，每个平皿加入18ml20ml，加盖待凝固后，把平皿倒置以防水分蒸发，于冰箱中保存备用(时间不超过2周)。1.3 禽流感琼扩抗原：标准阴性与标准阳性血清均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供，按说明书操作。4操作步骤：4.1 打孔：反应孔现用现打，将琼脂板从冰箱中取出，在酒精灯上稍加热蒸发其表面

51、水分，在制好的琼脂板上用外径为4mm的打孔器按七孔一组的梅花形图案打孔，中心孔与周围孔的孔距为3mm，将孔中的琼脂用8号针头轻轻向上挑出，注意勿伤边缘或使琼脂层脱离皿底。4.2封底：将制好的琼脂板在酒精灯火焰上稍加热至琼脂刚刚要溶化为止，以封闭孔的底部，防止琼脂与培养皿底分离和侧漏。4.3加样：用微量移液器吸取琼扩抗原滴加入图一中间孔，阳性对照血清分别加入周围1，4孔中，被检血清按编号顺序分别加入4个孔（2，3，5，6，）每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个吸头。23476115图一4.4反应：加样完毕后，静止5-10分钟待孔中液体吸干后，然后将培养皿轻轻倒置放入加盖湿盒内于371恒温

52、培养箱中作用2472小时，分别在24h、48h、72h对光观察结果病记录。5结果判定：5.1 判定方法：将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，标准阳性血清与抗原孔之间出现一条清晰的白色沉淀线，则试验可成立。5.2 判定标准：阳性：阳性血清与抗原孔之间有明显致密的沉淀线时，被检血清与抗原孔之间也形成沉淀线。或者阳性血清的沉淀线末端向毗邻的被检血清孔内侧偏弯者，此被检血清判为阳性（+）。弱阳性：被检血清与抗原孔之间没有沉淀线，但阳性血清的沉淀线末端向被检血清孔偏弯，此被检血清判为弱阳性（需重复试验）如重复试验还是弱阳性，则判为阴性（）阴性：被检血清与抗原孔之间不形成沉淀线，或者阳性血清的沉淀线向毗邻的被检血清孔直伸或向其外侧偏弯者，此被检血清判为阴性（）。6记录与报告：操作过程中做好记录，填写检测报告单，由相关责任人签名，及时传递到相关部门。禽流感（新城疫）微量红细胞凝集抑制试验1目的：提供禽流感微量红细胞凝集抑制试验的标准操作方法2相关材料：禽流感抗原、禽流感阳性血清、禽流感阴性血清、被检血清、1%鸡红细胞悬浮液、PBS液、离心机、微量振荡器、微量移液器、V型96孔微量反应板、100ul吸头、架盘天平、371恒温培养箱、氯化钠(分析纯)、吸耳球、培养皿、烧杯、柠檬酸钠(分析纯)、