northern杂交课件

1、Northern技术Northern技术简介Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法。 Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。Northern blot 在1977年由斯坦福大学James Alwine，David Kemp和George Stark发明。Northern blotting实际上依照比它更早发明的一项杂交技术Southern blot（依据生物学家 EdwinSouthern 名字来命名）来命名.步骤1. RNA1. RNA的提取的提取2

2、. 2. 甲醛甲醛的琼脂糖凝胶上的琼脂糖凝胶上RNARNA电电泳泳3. RNA3. RNA转膜转膜( (尼龙膜尼龙膜) )4.RNA4.RNA探针制备探针制备5.5.预预杂交杂交6.Northern 6.Northern 印迹杂交印迹杂交7.7.放射性自显影检测放射性自显影检测 步骤按分子量的大小分离RNA检测RNA是否降解1. RNA1. RNA的提取的提取2. 2. 甲醛的琼脂糖凝甲醛的琼脂糖凝胶上胶上RNARNA电泳电泳3. RNA3. RNA转膜转膜( (尼龙膜尼龙膜) )4.RNA4.RNA探针制备探针制备5.5.预杂交预杂交6.Northern 6.Northern 印迹杂印迹杂交

3、交7 7. .放射性自显影检放射性自显影检测测 步骤转移前胶在50mmol/L的NaoH中浸20min胶在20*SSC中浸40min 转膜方法:电转移法真空转移法细管虹吸印迹法1. RNA1. RNA的提取的提取2. 2. 甲醛的琼脂糖凝胶上甲醛的琼脂糖凝胶上RNARNA电泳电泳3. RNA3. RNA转膜转膜( (尼龙膜尼龙膜) )4.RNA4.RNA探针制备探针制备5.5.预杂交预杂交6.Northern 6.Northern 印迹杂交印迹杂交7 7. .放射性自显影检测放射性自显影检测 步骤核酸标记同位素标记(P)地高辛标记探针:DNA探针cDNA探针RNA探针1 1. . RNARNA

4、的提取的提取2. 2. 甲醛的琼脂糖凝胶上甲醛的琼脂糖凝胶上RNARNA电泳电泳3. RNA3. RNA转膜转膜( (尼龙膜尼龙膜) )4.RNA4.RNA探针制备探针制备5.5.预杂交预杂交6.Northern 6.Northern 印迹杂交印迹杂交7.7.放射性自显影检测放射性自显影检测 步骤预杂交目的: 用非特异性的DNA分子及其他高分子化合物封闭待测核酸分子中的非特异性结合位点,以减少杂交时的非特异性反应.1. RNA1. RNA的提取的提取2. 2. 甲醛的琼脂糖凝胶上甲醛的琼脂糖凝胶上RNARNA电泳电泳3. RNA3. RNA转膜转膜( (尼龙膜尼龙膜) )4.RNA4.RNA探

5、针制备探针制备5.5.预杂交预杂交6.Northern 6.Northern 印迹杂交印迹杂交7 7. .放射性自显影检测放射性自显影检测 步骤探针与RNA杂交1.RNA1.RNA的提取的提取2. 2. 甲醛的琼脂糖凝甲醛的琼脂糖凝胶上胶上RNARNA电泳电泳3. RNA3. RNA转转膜膜4.RNA4.RNA探针制备探针制备5.5.预杂交预杂交6.Northern 6.Northern 印迹杂印迹杂交交7.7.放射性自显影检测放射性自显影检测步骤在膜上压一张X线胶片,放于含增感屏的暗盒里,零下70度放射自显影24-48h(暗室中操作)1 1. RNA. RNA的提取的提取2. 2. 甲醛的琼脂糖凝甲醛的琼脂糖凝胶上胶上RNARNA电泳电泳3. RNA3. RNA转膜转膜( (尼龙膜尼龙膜) )4.RNA4.RNA探针制备探针制备5.5.预杂交预杂交6.Northern 6.Northern 印迹杂印迹杂交交7 7. .放射性