细胞培养工程 05 细胞培养生物反应器(I)

1、动物细胞培养动物细胞培养生物反应器生物反应器1细胞培养工程 南开大学1. 生物反应器概述2细胞培养工程 南开大学细胞培养生物反应器 基因工程技术出现之前 低血清贴壁培养动物细胞，用于病毒疫苗生产细胞培养工程 南开大学微生物发酵简史 1920s：酒精、甘油和丙酮等（厌氧发酵） 1940s：青霉素/抗生素、有机酸、微生素、激素等 （无菌技术与深层发酵 - 通气/搅拌) 1950s：谷氨酸/氨基酸、核苷酸、有机酸和部分抗生素 （代谢控制与菌种人工诱变） 1970s：定向育种、基因工程蛋白质表达4细胞培养工程 南开大学Molecular Cell Biology (5th ed.) by Lodish

2、 et al.微生物与动物细胞的主要差异 尺度 细胞壁 生长速度细胞培养工程 南开大学5微生物与动物细胞的主要差异 微生物细胞尺度小，有细胞壁，抗剪切力能力较强生长速度快，溶解氧（DO）需求较高 通气量：较高甚至很高 搅拌：能量输入较高，主体混合与微混合（搅拌桨） 动物细胞尺度大，无细胞壁，抗剪切力能力较差生长速度慢，溶解氧（DO）需求较低 通气量：较低 搅拌：能量输入较低，主体混合（搅拌桨）6细胞培养工程 南开大学细胞培养生物反应器：1980-90s（1） 微生物深层发酵技术已经相当成熟 搅拌式生物反应器设计和性能 控制与配套设施 细胞培养从有血清贴壁到无血清悬浮的过渡 能否悬浮生长（杂交瘤

3、细胞例外） 能否无血清生长 能否耐受反应器内搅拌剪切力 能否耐受通氧（气泡） 能否提高细胞密度，以提高生产效率7细胞培养工程 南开大学细胞培养生物反应器：1980-90s（2） 经过业内十余年的不懈努力，搅拌式生物反应器已经成为大规模细胞培养普遍采用的设备 可以悬浮生长 可以无血清甚至无蛋白生长 经过改进搅拌桨设计，可以耐受搅拌剪切力 在提供保护剂的条件下，可以耐受通氧 通过培养基合理设计，可以提高细胞密度 尽管大规模生产不采用，但是新颖生物反应器研发为干细胞、组织工程和新型技术奠定了基础 中空纤维、水凝胶固定化、微胶囊等 允许灌流操作（抗体浓度达到 25 g/L）8细胞培养工程 南开大学生物

4、反应器的主要功能（1） 为细胞生长提供一个与外界隔离的无菌环境 清洗（CIP） 高温灭菌（SIP） 混合搅拌功能 克服细胞重力沉降，并使其分布均匀 降低气泡尺度，延长气泡停留时间，提高氧传质效率 保证营养物和代谢产物分布均匀 避免温度、酸碱度局部过高（温度与 pH 控制启动）9细胞培养工程 南开大学生物反应器的主要功能（2） 通氧，避免培养基溶解氧（DO）过低 控制 对环境参数（搅拌桨转速、细胞浓度、温度、DO、pH 等）进行实时监控和记录，并维持在较窄的设定范围之内 出液（连续培养），补料（流加培养）10细胞培养工程 南开大学气升式生物反应器（Airlift Bioreactor） 剪切力较

5、小，90 年代曾用于大规模培养 操作灵活性较差，现不多用11细胞培养工程 南开大学搅拌式生物反应器 主流 操作灵活，可批次、流加或灌流，普遍使用12细胞培养工程 南开大学A 20,000-liter cell culture bioreactor system is installed in a Lonza Biologics plant in Singapore. A large-sale chromatography system in a Lonza Biologics Singapore plant （2008.08）13细胞培养工程 南开大学2.细胞悬浮培养模式14细胞培养工程 南开

6、大学生产细胞株 生产细胞株合成蛋白质产物的能力主要取决于 表达载体设计 表达载体在宿主细胞染色体上的整合位点是否位于转录活跃区（低于染色体 3%） 克隆筛选 传统：Limiting Dilution 现代方法：FACS 或其它专门仪器等 在没有选择压力（如 MTX 对 DHFR 系统）存在的条件下，细胞株必须能够生长足够代时且保持稳定的产物分泌能力15细胞培养工程 南开大学细胞株的生产能力 合成蛋白质产物的能力评估 单位时间内每个细胞分泌蛋白质的平均值 经克隆筛选之后，每个细胞株为单克隆，其合成蛋白质产物的能力基本上已经达到上限，重复筛选进一步提高产率的空间不大16细胞培养工程 南开大学工艺过

7、程开发与优化概括（1） 细胞驯化 来源可能是有血清贴壁培养 使细胞适应无血清或无蛋白悬浮培养 动力学研究 确定产物合成与细胞生长的关系 了解细胞的代谢特点，包括营养需求与副产物生成 了解物理参数的影响（如降温）17细胞培养工程 南开大学工艺过程开发与优化概括（2） 培养基优化 在渗透压允许范围内，平衡底物比例，以 提高活细胞密度 提高产物浓度 减少代谢副产物生成 采用高通量培养体系和统计学实验设计（DoE），以提高筛选效率，降低工作量 和成本18细胞培养工程 南开大学工艺过程开发与优化概括（3） 反应器操作模式 批次培养：培养基优化，生长培养基优化 流加培养： 补料培养基优化 延长高密度培养时

8、间19P=qpCv(t)dt0t细胞培养工程 南开大学010020030040050060070080090010001100110100Viable Cells (105/ml)t (hours)Viable Cells Viability0102030405060708090100Cell Weaning 20040221Viability（） 杂交瘤细胞无血清培养驯化过程细胞培养工程 南开大学21 抗体分泌 CHO 细胞的驯化细胞初始状态：贴壁，10% 牛血清第一阶段：悬浮驯化，10% 牛血清第二阶段：无蛋白培养驯化细胞培养工程 南开大学批次培养（间歇培养） 培养液接种细胞后，培养过程中

9、不再添加培养基，细胞生长消耗营养并形成产物，在营养消耗完后终结培养、回收产物 过程开发优化最基本培养方式底物细胞产物22细胞培养工程 南开大学批次培养（间歇培养） 培养液接种细胞后，培养过程中不再添加培养基或其它，细胞生长消耗营养并形成产物，在营养消耗完后终结培养、回收产物； 动力学研究 确定产物分泌与细胞生长的关系 生长相关 非生长相关 复合型 计算 产物比生产速率 主要底物比消耗速率23细胞培养工程 南开大学批次培养 - 高通量细胞培养系统 培养基成分品种多（50-70），且常伴有协调作用 每个营养成分对细胞株呈现不同作用模式，包括生长支持与生长抑制（毒性），因此需要确定单一成分的可采用剂

10、量范围，并为培养基优化和反应器操作模式选择提供基础 细胞计数工作量浩大 高通量培养结合 DOE24 细胞培养工程 南开大学加料连续培养（Continuous culture） 培养液接种细胞后，在合适时间启动培养基连续添加，并同时连续收获培养液，细胞密度、底物浓度和产物浓度处于稳态； 缺乏竞争优势（与灌流相比较），目前不常用底物细胞产物收获25细胞培养工程 南开大学流加培养（Fed-batch culture） 先将一定量培养液加入反应器，然后接种细胞。随着营养物质的消耗，启动新鲜培养基或成分添加机制，使细胞能在较长时间内维持较高密度生长和代谢； 工业生产最主要的培养方式。底物细胞产物加料26

11、细胞培养工程 南开大学灌流培养（Perfusion culture） 培养液接种细胞后，在合适时间启动培养基连续添加，并同时连续收获培养液，经细胞截留装置，截留细胞回流到反应器； 高细胞密度培养，目前尚有采用，。细胞培养基培养基产物回收产物回收27细胞培养工程 南开大学截留装置灌流培养（Perfusion culture） 主要细胞截留装置 中空纤维系统 内置钢丝网 细胞沉降倾斜扁管 活细胞沉降速度高于死细胞 活细胞沉降至底板、回流，死细胞随培养基溢出28细胞培养工程 南开大学3.生物反应器控制29细胞培养工程 南开大学生物反应器 过程参数检测与控制 溶解氧（DO） 维持细胞生长与代谢 设定浓

12、度适中 始终处于被消耗状态 矫正措施：通氧（顶部/底部） pH 乳酸形成（葡萄糖/谷氨酰胺代谢） 铵离子形成（谷氨酰胺/氨基酸代谢） CO2 形成 矫正措施：在 DO 或 pH 偏离设定值（范围）时自动启动通气或泵入所需溶液30细胞培养工程 南开大学生物反应器 过程参数检测与控制 控制理论：PID 反馈控制 Proportional：矫正量 Integral：矫正归位 Differential：矫正速度31细胞培养工程 南开大学生物反应器 过程参数检测与控制 DO 甘汞电极受溶液（化学成分）环境干扰比较大输出信号：电压 极谱氧电极电极不与培养基液体直接接触，由一层膜隔离氧分子跨膜扩散速率与DO

13、 浓度成正比输出信号：电流 耐高温灭菌 性能稳定32 pH电极 耐高温灭菌 性能稳定 温度电极 热电偶 性能稳定细胞培养工程 南开大学生物反应器 过程参数检测与控制 生物反应器控制的重要性 为细胞生长提供一个稳定的生理环境 DO、pH、温度在线自动控制相对比较容易实现 主要底物和代谢副产物通常在无菌取样后分析葡萄糖葡萄糖氧化酶乳酸乳酸脱氢酶谷氨酰胺谷氨酸脱氢酶/心肌磺酶/天冬酰胺酶铵离子谷氨酸脱氢酶氨基酸HPLC 现已有多种酶电极分析装置，可以提供在线检测，并可以根据设定值添加以维持某种底物的浓度恒定，但购置与使用成本很高。33细胞培养工程 南开大学支原体（Mycoplasma）http:/

14、年发现，为目前发现的最小、最简单的原核生物，大小介于细菌和病毒之间。支原体细胞中唯一可见的细胞器是核糖体。没有细胞壁，多数成球形，具有较大的可变性。支原体可以在特殊的培养基上接种生长，进行临床鉴定。形态形态 大小为 0.2 - 0.3 m，无细胞壁，形态呈现多形性，可通过滤膜； Giemsa 染色法呈淡紫色（革兰氏染色不易着色）； 细胞膜胆固醇含量丰富，约占 36%。基因组基因组 一个环状双链 DNA，分子量小（仅有大肠杆菌的1/5），合成与代谢能力很有限。生长生长特性特性 繁殖方式多样，二分裂繁殖为主，还有断裂、分枝、出芽等方式； 支原体细胞分裂与其 DNA 复制不同步，可形成多核长丝体；

15、体外培养需 10 - 20% 人或动物血清（胆固醇）； 最适 pH 7.8 - 8.0 ，一般低于 7.0 则死亡（解脲脲原体，pH 6.0 - 6.5）； 大多数兼性厌氧，生长缓慢，在琼脂含量较少的固体培养基上孵育 2 - 3 天出现典型的 “荷包蛋样” 菌落（圆形，直径 10 - 16 m），核心部分较厚，向下长入培养基，周边为一层薄的透明颗粒区； 支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜或培养细胞中生长；生化反应分型生化反应分型一般能分解葡萄糖的支原体不能利用精氨酸，能利用精氨酸的则不能分解葡萄糖，据此可将支原体分为两类；解脲脲原体不能利用葡萄糖或精氨酸，但可利用尿素作能源。表面抗原表面抗原 各种支原体都具有型特异性，少有交叉反应。抵抗力抵抗力 支原体对热的抵抗力与细菌相似；对环境渗透压敏感，渗透压的突变可致细胞破裂；对重金属盐、石炭酸、来苏尔和一些表面活性剂较细菌敏感，但对醋酸铊、结晶紫和亚锑