九原生质体融合原理技术应用PPT课件

1、历史沿革基本原理主要实验技术第2页/共28页第1页/共28页011、早期尝试期早期尝试期2、基础研究期基础研究期 营养营养3、新技术建立时期新技术建立时期 原生质体融合原生质体融合 植物细胞固化植物细胞固化 质粒转化原生质质粒转化原生质体体 体细胞克隆与变异体细胞克隆与变异4 4、植物生物技术期植物生物技术期 与基因工程结合与基因工程结合 产业化产业化第3页/共28页第2页/共28页02灭菌培养基培养保存第4页/共28页第3页/共28页021植物材料 灭菌前处理、表面灭菌剂、内感染2培养基 湿热、过滤3器皿和工具 干热、湿热、火焰灼烧4培养室5无菌技术 超净工作台 100级灭菌灭菌第5页/共2

2、8页第4页/共28页02水 双蒸水以上无机盐 大量 微量有机成分 碳源 蔗糖 葡萄糖 氨基酸 几种常用的 有能力合成，但刺激生长 产物合成前体 多种混合 维生素 有能力，但不够 几种常用的培养基培养基第6页/共28页第5页/共28页02生长调节剂 生长素 细胞激动素 促进分裂 打破顶芽休眠 促进茎的分化 赤霉素和脱落酸不确定成分混合物其他物质 琼脂 活性炭 去除植物细胞产生的 酚类、氧化物、丹宁PH 灭菌前5-6培养基培养基第7页/共28页第6页/共28页02仪器设备 常用仪器设备 培养器皿和设备 实验室设置培养条件 温度 低于植物生长温度3-4 光照 用于分化的细胞和光自养型细胞 氧培养类型

3、 愈伤组织 生长迅速 疏松 非褐化 单细胞培养 悬浮细胞培养 大量培养 发酵罐 生物反应器 植物细胞与微生物比较 固定细胞培养 特点 转化细胞培养培养培养第8页/共28页第7页/共28页03愈伤组织培养单细胞培养悬浮细胞培养大量培养固定细胞培养转化细胞培养细胞保存第9页/共28页第8页/共28页03愈伤组织培养1外植体的选择 外植体的来源 部位 年龄 生理状态 外植体的大小2培养基的配制 培养基的配制 大量成分 微量成分 有机成分 铁、激动素 按比例混合 调酸碱 定容 分装 灭菌 定容后加琼脂 融化 定容 培养基的选择 外植体 培养基 生长素 激动素四因子3愈伤组织的诱导 接种材料的灭菌 茎段

4、和叶：蜡质 表面活性剂擦 种子：一般的采用茎段和叶片的方法 根和地下器官无菌操作愈伤组织的培养第10页/共28页第9页/共28页03单细胞培养1单细胞的分离 机械法 酶法 悬浮培养法 愈伤组织在振荡器中培养， 过滤得到单细胞2单细胞的培养 看护培养：将亲本愈伤组织或高密度的悬浮细胞同低密度细胞一起培养，以促进低密度细胞生长、分裂的培养方法。 铺板培养 微室培养 第11页/共28页第10页/共28页03悬浮细胞培养悬浮细胞培养的建立 细胞系的建立 松散色淡的愈伤组织转入悬浮五代以上 培养 接种量1/5、1/2、1/10 继代培养 生长模式 封闭系统中S型曲线培养基的选择 培养基的特点 酸碱缓冲能

5、力差 生长素的浓度 条件培养 低密度培养液中放高密度培养悬浮细胞的透析袋细胞生活力和生长的测定 生活力测定 荧光素二乙酸酯法、伊万兰染色法 细胞生长的测定 细胞计数法、干重、鲜重、堆积细胞体积法 第12页/共28页第11页/共28页03大量培养1高产细胞系的筛选 颜色目视（紫草素） 化学分析（生物碱）2种子的准备 逐级继代培养3生物反应器的设计 获得产品生物反应器 得到细胞发酵罐4培养条件的最适化 混合、通气、剪切力、温度、PH5培养系统的操作 成批培养、半连续培养、连续培养6测定方法 电导率测定、kla测定 第13页/共28页第12页/共28页03固定细胞培养细胞固定 在胶体中固定植物细胞

6、在网或泡沫中固定 空心纤维膜中固定固定细胞反应器的设计 流动床式 固定床式第14页/共28页第13页/共28页03转化细胞培养转化 根瘤农杆菌 转化细胞的建立 叶片 悬浮液 不要没过 诱导愈伤组织 转化细胞的培养 农杆菌质粒中携带生长素基因转化细胞的分析 转化细胞的筛选 抗性基因 报道基因 标记基因 外源基因表达 产物积累（生物、免疫、化学）第15页/共28页第14页/共28页03细胞保存冷冻保存 冷冻 慢冻 快冻 茎尖保存 分部冻 茎尖 芽 悬浮培养 慢 中间温度30min 液氮快 干冻 真空脱水 液氮保藏 维持 融冰 液氮迅速37-40度90s后 室温 再培养冷藏保存 1-9度下仍需继代培

7、养低压保存低氧保存第16页/共28页第15页/共28页植物细胞中主要生理活性物质和其他化学组分植物细胞技术的优缺点应用实例一二三第17页/共28页第16页/共28页011.生理活性物质（1）酶类:淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶（2）维生素:辅酶（3）植物激素（4）抗生素和植物杀菌素:蒜，葱，萝卜第18页/共28页第17页/共28页012.其他成分（后含物）（1）生物碱:罂粟科，茄科（2）糖苷类:洋地黄毒苷（3）挥发油:薄荷油，丁香油（4）有机酸:苹果酸，柠檬酸，水杨酸第19页/共28页第18页/共28页03工业化产品希腊毛地黄细胞 生物转化 地高辛地高辛日本黄连细胞 黄连碱黄连碱人参根细胞 人参皂甙人

8、参皂甙中试水平长春花 吲哚生物碱丹参 丹参酮青蒿 青蒿素红豆杉 紫杉醇紫草 萘醌三七 皂甙第20页/共28页第19页/共28页021、不受地区、季节、土壤及有害生物的影响2、节约农田 3、在无菌条件下完成的, 能排除病菌及虫害对药用植物的侵扰; 4、研究植物的代谢途径, 探索或创造新的合成路线5、人工控制提高代谢物产量 优点第21页/共28页第20页/共28页02(1)生长周期长,易污染。(2)生物反应器的设计装置要求较高。(3)高产细胞株较难获得。缺点第22页/共28页第21页/共28页03发状根、冠瘿组织细胞培养技术 激素自主 增殖快常规细胞 次生代谢物含量高、种类广悬浮培养细胞 桔味薄荷

9、冠瘿细胞 萜烯 洋地黄冠瘿细胞 强心甙 丹参冠瘿细胞 丹参酮 长春花冠瘿细胞 吲哚生物碱 人参发状根培养 人参皂甙 长春花发状根培养 长春碱 青蒿发状根培养 青蒿素 萝芙木发状根培养 生物碱第23页/共28页第22页/共28页03两相培养技术 培养体系形成上、下两相,细胞在水相中生长与合成次生物质,然后分泌出来转移到有机相中。 减少减少反馈抑制反馈抑制 产量产量提高提高 有机相循环使用有机相循环使用, ,连续培养连续培养, ,成本降低成本降低 长春花细胞 XAD-7大孔吸附树脂 吲哚生物碱 花菱草悬浮细胞 液体硅胶 血根碱 第24页/共28页第23页/共28页03 美国 白细胞介素 荷兰 转基因马铃薯 血清白蛋白 南朝鲜 转基因烟草和番茄 人胰岛素 BoyceThompson研究所 马铃薯 食用霍乱疫苗 美国 开发研究烟草 治疗人类高歇氏病和费勃莱氏病的酶 新思路：以病毒为载体在植物中生产药用蛋白，还处在实验阶段药用蛋白(1)易吸收(2)安全(3)简化下游纯化工艺第25页