双水相萃取技术g课件

1、双水相萃取技术g1双水相萃取技术双水相萃取技术1.1 1.1 双水相系统双水相系统1.2 1.2 双水相中的分配平衡双水相中的分配平衡1.3 1.3 影响物质分配平衡的因素影响物质分配平衡的因素1. 4 1. 4 双水相系统的应用双水相系统的应用 基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固液分离带来了困难，同时这类产品的变化给固液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们在

2、有机溶剂中的溶解度低并特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。有机溶剂萃取的不足：有机溶剂萃取的不足：许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶剂;蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。双水相萃取的优点双水相萃取的优点: 使固液分离和纯化两个步骤同时进行，一步完成；使固液分离和纯化两

3、个步骤同时进行，一步完成； 适合热敏物质的提取，主要是胞内酶；适合热敏物质的提取，主要是胞内酶； 亲水性聚合物加入水中，形成两相，在这两相中，水亲水性聚合物加入水中，形成两相，在这两相中，水 分都占大比例（分都占大比例（8595），这样生物活性蛋白质在），这样生物活性蛋白质在两相中不会失活，且以一定比例分配于两相中。两相中不会失活，且以一定比例分配于两相中。 物质类型物质类型物质物质P的名称的名称物质物质Q的名称的名称两种非离子型聚合两种非离子型聚合物物聚丙二醇聚丙二醇聚乙二醇聚乙二醇 聚乙烯醇聚乙烯醇葡聚糖（葡聚糖（Dx）羟丙基葡萄糖羟丙基葡萄糖 聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）聚乙烯醇聚乙烯醇

4、葡萄糖葡萄糖 (Dx)聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯吡咯烷酮P为带电荷聚电解质为带电荷聚电解质硫酸葡聚糖钠盐硫酸葡聚糖钠盐羧甲基葡聚糖钠盐羧甲基葡聚糖钠盐聚丙二醇、聚乙二醇聚丙二醇、聚乙二醇甲基纤维素甲基纤维素P Q都为聚电解质都为聚电解质 羧甲基葡聚糖钠盐羧甲基葡聚糖钠盐羧甲基纤维素钠盐羧甲基纤维素钠盐P为聚合物为聚合物Q为盐类为盐类 聚乙二醇聚乙二醇 磷酸钾、硫酸铵、硫酸钠磷酸钾、硫酸铵、硫酸钠硫酸镁、酒石酸钾钠硫酸镁、酒石酸钾钠双水相萃取技术g6a双节线系线b双节线均相区均相区两相区两相区系线临界点图分别为图分别为PEG/葡萄糖葡萄糖(Dx)和和PEG/磷酸钾磷酸钾(KPi)系统的典型相图系统的典

5、型相图 在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即 系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时，即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为1，因此K点称为临界点(critical point)。 与溶剂萃取相同，溶质在双水相中的分配系与溶剂萃取相同，溶质在双水相中的分配系数也用数也用m=c2/c1表示。为简便起见，用表示。为简便起见，用c1 和和c2分分别表示平衡状态下下相和上相中溶质的总浓度。别表示平衡状态下下相和上相中溶质的总浓度。 生物分子的分配系数

6、取决于溶质与双水相系生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间的各种相互作用，其中主要有统间的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏静电作用、疏水作用和生物亲和作用水作用和生物亲和作用等。等。 lnm=lnme+lnmh+lnml 非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影响，非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影响，利用相平衡热力学理论可推导下述分配系数表达式：利用相平衡热力学理论可推导下述分配系数表达式：lnlnm m = -M/RT= -M/RTm-m-分配系数；分配系数；M-M-溶质的相对分子质量；溶质的相对分子质量；-与溶质表面性质和与溶质表面性质和成相系统有关的常数成相系统有关的常数

7、; R-; R-气体常数，气体常数，J/(mo1J/(mo1K)K)；T-T-绝对温度，绝对温度，K K。 因此，溶质的分配系数的对数与相对分子质量之因此，溶质的分配系数的对数与相对分子质量之间呈线性关系，在同一个双水相系统中，若间呈线性关系，在同一个双水相系统中，若00，不，不同溶质的分配系数随相对分子质量的增大而减小。同同溶质的分配系数随相对分子质量的增大而减小。同一溶质的分配系数随双水相系统的不同而改变，这是一溶质的分配系数随双水相系统的不同而改变，这是因为式中的因为式中的随双水相系统而异。随双水相系统而异。双水相萃取技术g10 实际的双水相系统中通常含有缓冲液和无机盐等实际的双水相系统

8、中通常含有缓冲液和无机盐等电解质，当这些离子在两相中分配浓度不同时电解质，当这些离子在两相中分配浓度不同时( (即分即分配系数配系数1)1)，将在两相间产生电位差，此时，荷电溶，将在两相间产生电位差，此时，荷电溶质的分配平衡将受相间电位的影响，从相平衡热力学质的分配平衡将受相间电位的影响，从相平衡热力学理论推导溶质的分配系数表达式为理论推导溶质的分配系数表达式为lnm=lnmo+FZ/RT 因此，荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正因此，荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比比, ,由于同一双水相系统中添加不同的盐产生的相间电位不同，由于同一双水相系统中添加不同的盐产生的相间电

9、位不同，故分配系数与静电荷数的关系因无机盐而异故分配系数与静电荷数的关系因无机盐而异. . PEG/Dx和和PEG/无机盐等双水相系统的上相无机盐等双水相系统的上相(PEG相相)疏水疏水性较大，相间的疏水性差用疏水性因子性较大，相间的疏水性差用疏水性因子HF (hydrophoblc factor)表示。表示。HF可通过测定疏水性已知的氨基酸在其等电点可通过测定疏水性已知的氨基酸在其等电点处的分配系数处的分配系数maa测算测算lnmaa=HF(RH+B)其中，其中，RH为氨基酸的相对疏水性为氨基酸的相对疏水性(relative hydrophobicity)，是通过测定氨基酸在水和乙醇中溶解度

10、的差别确定的，并设是通过测定氨基酸在水和乙醇中溶解度的差别确定的，并设疏水性最小的甘氨酸的疏水性最小的甘氨酸的RH0。所以上式中。所以上式中 B为为 B = lnmGly/HFpHpI时氨基酸在双水相系统中的分配系数与其时氨基酸在双水相系统中的分配系数与其RH值呈线性关系，值呈线性关系，直线的斜率就是该双水相系统的直线的斜率就是该双水相系统的HF值。值。双水相萃取技术g14 如果在如果在pH为等电点的双水相中蛋白质的分配系数为等电点的双水相中蛋白质的分配系数(m0)与与HF值之间呈线性关系，则直线的斜率定义为该蛋白质值之间呈线性关系，则直线的斜率定义为该蛋白质的表面疏水性，用的表面疏水性，用H

11、FS (hydrophobic factor of solutes)表示表示lnm0=HF HFS盐浓度对血红蛋白分配系数的影响PEG/Dx,pH=pI;NaCl(mol/kg):() 0; () 0.6; () 1; () 2从实验结果可知从实验结果可知,蛋白质的表面疏水性蛋白质的表面疏水性HFS随添加随添加NaCl浓度的增大而增大浓度的增大而增大.将盐对蛋白质疏水性的影将盐对蛋白质疏水性的影响引入上式，则响引入上式，则lnm0=HF( HFS+ HFS)式中，式中， HFS为盐浓度增加引起的为盐浓度增加引起的HFS值增量。因此：值增量。因此：lnm=HF(HFS+HFS)+ FZ/RT该式

12、较全面地描述了双水相系统的疏水性和相间该式较全面地描述了双水相系统的疏水性和相间电位、蛋白质的疏水性和净电荷数对分配系数的电位、蛋白质的疏水性和净电荷数对分配系数的影响，同时也间接地通过盐对蛋白质表面疏水性影响，同时也间接地通过盐对蛋白质表面疏水性和相间电位的影响表现了盐对蛋白质分配系数的作用。和相间电位的影响表现了盐对蛋白质分配系数的作用。双水相萃取技术g151.3 影响物质分配平衡的因素影响物质分配平衡的因素 聚合物的分子量聚合物的分子量 聚合物的浓度聚合物的浓度分子量越小，蛋白质容易分配于富含该聚合物的相中。分子量越小，蛋白质容易分配于富含该聚合物的相中。l当接近分配的临界点蛋白质均匀分

13、配于两相中，分配系数接近当接近分配的临界点蛋白质均匀分配于两相中，分配系数接近1；l成相聚合物的总浓度或聚合物成相聚合物的总浓度或聚合物/盐浓度的比例增加时，系统远离平衡盐浓度的比例增加时，系统远离平衡点，此时两相性质的差别增加，蛋白质容易趋向于某一极。点，此时两相性质的差别增加，蛋白质容易趋向于某一极。双水相萃取技术g163. 盐的种类和浓度盐的种类和浓度4. pH值值5. 温度温度 盐的种类盐的种类(离子组成离子组成)影响蛋白质、核酸等生物大分子的分配影响蛋白质、核酸等生物大分子的分配系数，盐浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且扰乱双水相系数，盐浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性，而且扰乱双水

14、相系统，改变各相中成相物质的组成和相体积比。系统，改变各相中成相物质的组成和相体积比。 pH值影响蛋白质的解离度，调节值影响蛋白质的解离度，调节pH值可改变蛋白质的表面值可改变蛋白质的表面电荷数，从而改变分配系数。电荷数，从而改变分配系数。 温度影响双水相系统的相图，因而影响蛋白质的分配系数。温度影响双水相系统的相图，因而影响蛋白质的分配系数。但一般来说，当双水相系统离双节线足够远时，温度的影响很小，但一般来说，当双水相系统离双节线足够远时，温度的影响很小，12度的温度改变不影响目标产物的萃取分离。度的温度改变不影响目标产物的萃取分离。 目前已知的胞内酶约目前已知的胞内酶约2500种，但投入生

15、产的很种，但投入生产的很少。原因之一是提取困难。胞内酶提取的第一步系将少。原因之一是提取困难。胞内酶提取的第一步系将细胞破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小的细胞破碎得到匀浆液，但匀浆液黏度很大，有微小的细胞碎片存在，欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心细胞碎片存在，欲将细胞碎片除去，过去是依靠离心分离的方法，但非常困难。分离的方法，但非常困难。双水相系统可用于细胞碎双水相系统可用于细胞碎片以及酶的进一步精制。片以及酶的进一步精制。1. 双水相萃取法常用于胞内酶提取双水相萃取法常用于胞内酶提取1.4 双水相萃取的应用双水相萃取的应用双水相萃取技术g18酶酶菌种菌种相系统相系统收率收率(%)分配

16、系数分配系数纯化因子纯化因子细胞浓度细胞浓度(%)延胡索酸酶延胡索酸酶Brevibacterium ammoniagenesPEG/盐盐833.37.520天门冬氨酸酶天门冬氨酸酶E. ColiPEG/盐盐965.76.625异亮氨酰异亮氨酰tRNA 合成酶合成酶E. ColiPEG/盐盐933.62.320-半乳糖苷酶半乳糖苷酶E. ColiPEG/盐盐876.29.312亮氨酸脱氢酶亮氨酸脱氢酶Bacillus sphaericusPEG/Dx989.52.420甲醛脱氢酶甲醛脱氢酶Candida boidiniiPEG/盐盐9411-20葡萄糖异构酶葡萄糖异构酶Streptomyces

17、sp.PEG/盐盐863.02.520延胡索酸酶延胡索酸酶E. ColiPEG/盐盐933.23.425利用双水相从细胞碎片中提取胞内酶的典型例子利用双水相从细胞碎片中提取胞内酶的典型例子双水相萃取技术g19分离物质分离物质举例举例体系体系分配系数分配系数收率收率/%核酸核酸分离有活性核酸分离有活性核酸DNAPEG/Dextran-生长素生长素人生长激素的纯化人生长激素的纯化PEG/盐盐6.460病毒病毒脊髓病毒和线病毒脊髓病毒和线病毒PEG/NaDS-90干扰素干扰素分离分离-干扰素干扰素PEG-磷酸酯磷酸酯/盐盐63097细胞组织细胞组织分离含有胆碱受体分离含有胆碱受体的细胞的细胞三甲胺三

18、甲胺- PEG/Dextran3.6457双水相萃取技术在其它分离过程中的应用双水相萃取技术在其它分离过程中的应用双水相萃取技术g20细胞匀浆液细胞匀浆液+PEG/盐（或葡萄糖）PEG/盐或盐或PEG/Dx萃取系统萃取系统相分离下相下相上相（上相（ PEG)(细胞碎片，杂蛋白，多糖，核酸）（目标产物，杂蛋白，多糖，核酸）+盐PEG/盐萃取系统盐萃取系统相分离下相下相上相（上相（ PEG)（杂蛋白，多糖，核酸）（目标产物）+盐PEG/盐萃取系统盐萃取系统下相下相（杂蛋白，盐）相分离上相上相（PEG，目标产物）三步萃取流程示意图：三步萃取流程示意图： 欲提取的酶和细胞应分配在不同的相中；欲提取的酶和细胞应分配在不同的相中； 酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时，经过一次萃取，就能得到高的收率；比时，经过一次萃取，就能得到高的收率； 两相用离心机很容易分离。两相用离心机很容易分离。2. 双水相反应双水相反应 在双水相系统中进行转化翻译功能，如酶促反应，在双水相系统中进行转化翻译功能，如酶促反应，可以把产物移入另一相中，消除产物抑制，因而提高可以把产物移入另一相中，消除产物抑制，因而提高了产率。这实际上是一种反应和分离耦合的过程，有了产率。这实际上是一种反应和分离耦合的过程，有时也称为萃取生物转化