蛋白质理化性质PPT课件

1、1第四章第四章 蛋白质的理化性质蛋白质的理化性质杨学习2一、热力学和动力学基础n热力学n研究热现象中物质系统在平衡时的性质和建立能量的平衡关系，以及状态发生变化时系统与外界相互作用的学科。 n动力学基础n研究作用于物体的力与物体运动的关系 3世界处于永恒的运动变化之中：世界处于永恒的运动变化之中：n地壳：地壳：沧海桑田沧海桑田n人生：人生：生老病死生老病死n植物：植物：花开花落花开花落n气象：气象：风雨雷电风雨雷电万事万物变化的规律是什么？万事万物变化的规律是什么？4 一切自然界的过程是有方向性的一切自然界的过程是有方向性的。 如：如： 热的传递：热的传递：总是从高温物体自动传向低温物体，直至

2、平衡（即温度均一）。 气体的流动气体的流动：从高压处自动流向低压处，直至各处压强相等。 电流电流：总是从高电势自发的流向低电势处，直至各处的电势相等，等等。 5热力学第一定律即能量守恒定律宇宙的能量是一个常数，能量可以不断被转化和转移，但不可能被创造，也不可能被消灭n 1.热力学第一定律 6热力学第二定律热力学第二定律 人们曾试图用热力学第一定律所建立的状态函数判断：在一定的条件下，一化学变化或物理变化能否自发的进行？进行到何种程度？ 热力学第二定律热力学第二定律 人们曾试图用热力学第一定律所建立的状态函数判断：在一定的条件下，一化学变化或物理变化能否自发的进行？进行到何种程度？其中比较著名的

3、是汤姆逊汤姆逊塞罗规则塞罗规则：在没有外来能量的干预下，一切化学变化都是朝着放出能量最多的方向进行。即，凡放热反应能自动进行，而吸热反应均不能自动进行。7 然而，更多的研究发现：有不少吸热反应也能自动进行。c（s）+ h2o（g）=co（g）+ h2（g） 是一个吸热反应，但仍能自动的进行一个吸热反应，但仍能自动的进行。 热力学第一定律热力学第一定律只能告诉人们一化学反应中的能量效应，却无法解释，一定条件下，一个化学反应能否自动进行及进行到何种程度。也即无法解决无法解决化学变化的方向和限度问化学变化的方向和限度问题题。82.热力学第二定律的经典表述热力学第二定律的经典表述1.克劳修斯克劳修斯：

4、不可能将热从低温物体转到不可能将热从低温物体转到高温物体，而不引起其它的变化。高温物体，而不引起其它的变化。2开尔文：开尔文：不可能从单一的热源取出热使不可能从单一的热源取出热使之完全转化为功，而不发生其它的变化。之完全转化为功，而不发生其它的变化。9热力学将不能做功的随机和无序状态的能定义为熵，以s表示宇宙或系统的各种过程总向着熵增大的方向进行2.1热力学第二定律 之熵判据10在在孤立体系孤立体系或或绝热体系绝热体系中系统一切可以发生中系统一切可以发生的过程要么是熵变为的过程要么是熵变为0（可逆，平衡态），（可逆，平衡态），要么熵变大于要么熵变大于0（不可逆）。熵不可能减小，（不可逆）。熵不

5、可能减小，即即熵总是增大的熵总是增大的。 11热力学将系统中总的热量称为焓，以h表示在恒定温度和压力条件下总能量中可以做功的那一部分能量为自由能，以g表示dg = dh-tds (t为绝对温度)因此，当熵增加时，系统的自由能便会下降2.2热力学第二定律 之自由能判据12 在一个反应中，如果产物比反应物含有更少的自由能，这个反应便趋向于自发地进行13物理和化学过程达到平衡时， 即达到系统的自由能最小而熵最大14二、蛋白质折叠的热力学定律n熵判据和蛋白质折叠n自由能判据和蛋白质折叠n蛋白质折叠的热力学假说151.熵判据和蛋白质折叠未折叠的状态包含很多具有不同构象的分子。1617疏水作用是熵驱动的自

6、发过程n当疏水化合物或基团进入水中，它周围的水分子将排列成刚性的有序结构，即形成所谓笼形结构，最常见的就是五角形十二面体笼形结构，这种结构比冰更为有序。n但当疏水作用发生时，笼型结构被破坏，这部分水分子被排入自由水中，使得体系的混乱度增加，即熵值增加。n同时，疏水基团的聚集是有序化的过程，熵值减少，但其变化值不大，一般对蛋白质折叠不起主要作用。18疏水作用是多肽链折叠的主要驱动力，疏水作用的主要动力来自于蛋白质溶液体系的熵值的增加。疏水作用是熵驱动的自发过程192.吉布斯自由能判据和蛋白质折叠吉布斯自由能判据和蛋白质折叠g= h- ts20n吉布斯自由能变化应同时考虑多肽链和溶剂两者对体系焓值

7、变化和熵值变化的贡献 g总=h链+h溶剂- ts链- ts溶剂n折叠态蛋白质与伸展态相比,是一种高度有序化的结构, 因此s链是负数, 则-ts链为正值。nh链对疏水侧链为正值,从而有利于伸展态。21nh溶剂对疏水侧链是负值,有利于折叠态。这是因为蛋白质处于折叠态时,许多水分子之间的相互作用将代替水分子和疏水侧链的相互作用。nh链与h溶剂值都不大,一般对折叠不起主要作用。n蛋白质折叠过程中会打破水的有序化,则s溶剂为较大的正值,因而有利于折叠态。n对于典型的蛋白质来说,对折叠结构的稳定性做出单项最大贡献的是疏水残基引起的s溶剂。n在不同类型的蛋白质中,总熵变化和总焓变化所做的贡献是不同的,但结果

8、一样,蛋白质折叠结构是生理条件下自由能最低的构象。因此,从吉布斯自由能的变化值来考虑,多肽链的折叠是热力学中的自发过程223.“热力学假说”n天然蛋白质多肽采取的构象是在一定环境条件下热力学上最稳定的构象，采取天然构象的多肽链和它所处的一定环境条件（如溶液组分、ph、温度、离子强度等）整个系统的自由能最低，所以处于变性状态的多肽链在一定的环境条件下能够自发折叠成天然构象。2324三、蛋白质折叠的动力学nthe levinthal paradoxn中间体n动力学假说251.the levinthal paradoxn当蛋白折叠是构象搜索时，将会有太多的构象需要尝试。n仅仅考虑蛋白的主链，每个残基

9、在未折叠时假设只有3个构象，对一个有100aa的多肽来说将有 3100 构象。n如果构象搜索的速度是 1012 构象/s，需要5 x 1035 s (1.6 x 1028 y)n蛋白质折叠不是随机的，而是有捷径的。262.中间体n在蛋白质从变性态折叠成天然态的过程中，通常要经历若干个中间的分子构象状态，即蛋白折叠中间体，也叫做部分折叠态。它们具通常具有部分天然蛋白的结构，相对分子量相同，是分子构象不同的同一种蛋白质。27熔球态熔球态 (melton globule) n熔球态是折叠的中间体，快速步骤，在折叠途径中第一个可观测的、柔性无序的未折叠多肽链卷折成局部有组织的球状态，称为熔球体。n熔球

10、体的形成的驱动力：疏水侧链的包埋28分子伴侣和折叠酶帮助越过能障29折叠能量“地貌”原理图n未折叠的蛋白具有高的构象熵和高的能量。n折叠过程中漏斗变窄表示构象的种类下降。n两边的低洼处表示半稳定的中间体，这些中间体可以减慢折叠过程。n底部表示所有的中间体都到达了天然结构。30有人提出有人提出n若某一多肽链具有2种低能量状态：一种是天然构象，一种是非天然构象，而且处于这2种能量状态的多肽链的相互转变由于要克服较高的能垒而难以实现，那么在蛋白折叠过程中会有2种途径相互竞争，一种是正确折叠成天然构象的途径，另一种是错误折叠成稳定的非天然构象途径。311型人胰岛素生长因子实验n存在2种稳定构象天然构象

11、错配二硫键的非天然构象n多肽链具相似自由能n但二级结构成分不同323.“动力学假说”n90年代辅助蛋白(accessory protein ) 的发现细胞内新生肽段的折叠一般意义上说是需要帮助的，而不是自发进行的。n帮助蛋白质折叠的生物大分子主要是分子伴侣和折叠酶。n不仅仅受“热力学”控制，也受到“动力学”的控制。33一级结构一级结构二级结构二级结构疏水塌缩疏水塌缩前熔球态前熔球态高度有序的熔球态高度有序的熔球态天然态天然态快 过 程快 过 程毫秒内毫秒内疏水塌缩、氢键的形成疏水塌缩、氢键的形成和二级结构单元的堆积和二级结构单元的堆积慢过程，从慢过程，从100 ms到几到几分钟，几小时不等。分

12、钟，几小时不等。在折叠过程中脯氨酰从非天然的反式构象向天然在折叠过程中脯氨酰从非天然的反式构象向天然态的顺式构象转变的慢异构化过程导致了折叠的态的顺式构象转变的慢异构化过程导致了折叠的慢相反应慢相反应3435the rules governing protein folding are complexn热力学n动力学n特殊蛋白n？被列为“21世纪的生物物理学”的重要课题 36四、折叠机制的理论模型四、折叠机制的理论模型1框架模型（框架模型（framework model） 框架模型假设蛋白质的局部构象依赖于局部的氨基酸序列。在多肽链折叠过程的起始阶段, 先迅速形成不稳定的二级结构单元； 称为“

13、flickering cluster”, 随后这些二级结构靠近接触, 从而形成稳定的二级结构框架；最后，二级结构框架相互拼接，肽链逐渐紧缩，形成了蛋白质的三级结构。这个模型认为即使是一个小分子的蛋白也可以一部分一部分的进行折叠, 其间形成的亚结构域是折叠中间体的重要结构。 372.疏水塌缩模型（hydrophobic collapse model） 在疏水塌缩模型中，疏水作用力被认为是在蛋白质折叠过程中起决定性作用的力的因素。在形成任何二级结构和三级结构之前首先发生很快的非特异性的疏水塌缩。疏水内核包埋折叠机制的理论模型折叠机制的理论模型 383.扩散扩散-碰撞碰撞-粘合机制粘合机制 （dif

14、fusion-collision-adhesion model） 该模型认为蛋白质的折叠起始于伸展肽链上的几个位点，在这些位点上生成不稳定的二级结构单元或者疏水簇，主要依靠局部序列的近程或中程（3-4个残基）相互作用来维系。它们以非特异性布朗运动的方式扩散、碰撞、相互黏附，导致大的结构生成并因此而增加了稳定性。进一步的碰撞形成具有疏水核心和二级结构的类熔球态中间体的球状结构。球形中间体调整为致密的、无活性的类似天然结构的高度有序熔球态结构。最后无活性的高度有序熔球态转变为完整的有活力的天然态。 折叠机制的理论模型折叠机制的理论模型 394.成核成核-凝聚凝聚-生长模型（生长模型（nuclear

15、-condensation-growth model） 根据这种模型，肽链中的某一区域可以形成“折叠晶核”，以它们为核心，整个肽链继续折叠进而获得天然构象。所谓“晶核”实际上是由一些特殊的氨基酸残基形成的类似于天然态相互作用的网络结构，这些残基间不是以非特异的疏水作用维系的，而是由特异的相互作用使这些残基形成了紧密堆积。晶核的形成是折叠起始阶段限速步骤。 折叠机制的理论模型折叠机制的理论模型 405.拼版模型（拼版模型（jig-saw puzzle model） 此模型的中心思想就是多肽链可以沿多条不同的途径进行折叠, 在沿每条途径折叠的过程中都是天然结构越来越多, 最终都能形成天然构象, 而

16、且沿每条途径的折叠速度都较快, 与单一途径折叠方式相比, 多肽链速度较快, 另一方面, 外界生理生化环境的微小变化或突变等因素可能会给单一折叠途径造成较大的影响，而对具有多条途径的折叠方式而言, 这些变化可能给某条折叠途径带来影响, 但不会影响另外的折叠途径, 因而不会从总体上干扰多肽链的折叠, 除非这些因素造成的变化太大以致于从根本上影响多肽链的折叠。折叠机制的理论模型折叠机制的理论模型 41五、蛋白质折叠研究意义五、蛋白质折叠研究意义n生物工程应用n认识与折叠有关的疾病n蛋白质分子设计n。42目前生物制药大多采用大肠杆菌作为宿主细胞目前生物制药大多采用大肠杆菌作为宿主细胞n 43大肠杆菌表

17、达的重组蛋白易形成包含体大肠杆菌表达的重组蛋白易形成包含体 高效表达的目的蛋白高效表达的目的蛋白 在大肠杆菌内形成大在大肠杆菌内形成大 量无活性包含体。量无活性包含体。 因无法有效的解决复因无法有效的解决复 性问题，在美国每年性问题，在美国每年 造成的经济损失就达造成的经济损失就达 几十亿美元几十亿美元 包含体电镜图包含体电镜图441、生物工程应用、生物工程应用n“瓶颈”问题：在简单的微生物细胞内引入异体dna后所合成的多肽链往往不能正确折叠成为有生物活性的蛋白质而形成不溶解的包含体或被降解。n这一“瓶颈”问题的彻底解决有待于对新生肽链折叠更多的认识。45体外分子伴侣的实际应用体外分子伴侣的实

18、际应用分子伴侣groel相当于无活性蛋白的亲合配基；利用固定化小分子伴侣对体外无活性蛋白进行复性；利用人工合成分子伴侣。462.与折叠有关的疾病与折叠有关的疾病(“构象构象病病”)n“分子病”:由于基因突变造成蛋白质分子中仅仅一个氨基酸残基的变化就引起疾病的情况，如地中海镰刀状红血球贫血症 n“折叠病”:蛋白质分子的氨基酸序列没有改变，只是其结构或者说构象有所改变引起的疾病。n由于蛋白质折叠异常而造成分子聚集甚至沉淀或不能正常转运到位 47常见常见“折叠病折叠病”n老年性痴呆症(alzheimer syndrome)n病人脑中充满了由错误折叠蛋白形成的杂乱的蛋白质簇。主要分为两类：含有沉淀样蛋

19、白（a ）的沉淀样斑，tau蛋白引起的神经细胞内自损伤。n帕金森氏症（parkinson disease）n主要是由于蛋白质的错误折叠，病人随意运动的控制能力逐渐丧失，因为能产生多巴胺的神经细胞逐步被破坏，其原因和发生机制尚不清楚。n某些肿瘤n抑癌基因突变造成抑癌基因编码的蛋白质稳定性改变引起的一些癌症的发生。p53稳定性的降低导致癌症的发生。48what causes mad cow?stanley b.p prusiner，1997，nobel price 493.朊病毒的发现及命名朊病毒的发现及命名n作为传染性海绵脑病（朊病毒病）原型的绵羊痒病已作为传染性海绵脑病（朊病毒病）原型的绵羊痒

20、病已有有260多年历史多年历史n 1982年年prusiner首次提出朊病毒假说，人们才认识首次提出朊病毒假说，人们才认识到它的病源物到它的病源物 ；prusiner博士也因朊病毒的发现而获博士也因朊病毒的发现而获得诺贝尔生理和医学奖。得诺贝尔生理和医学奖。nprion一词创于一词创于1982年用来命名可转移性海绵状脑病年用来命名可转移性海绵状脑病的致病因子。的致病因子。80年代中期我国学者译之为朊病毒。年代中期我国学者译之为朊病毒。 n1983年年“植物和动物亚病毒病源：类病毒和朊病毒国植物和动物亚病毒病源：类病毒和朊病毒国际会议际会议”正式把朊病毒归入亚病毒领域正式把朊病毒归入亚病毒领域5

21、0prion的研究the nobel assembly has awarded the nobel prize in physiology or medicine for 1997 to stanley b. prusiner, for his discovery of prions - a new biological principle of infection. 513.1prion致病机制nprion疾病起始于正常的prpc发生错误折叠，形成富含 - -折叠结构的、抗蛋白酶水解的折叠结构的、抗蛋白酶水解的prpsc，错误折叠的prpsc有很强的聚集倾向，先形成淀粉样的小纤维，成为形成淀

22、粉样斑块的前体，进一步聚合形成淀粉样斑块，最后发展为可被临床诊断的大脑海绵状退化变性病症。52牛牛prpsc与与prpc结构的比较结构的比较 prpc prpscn -螺旋螺旋 36.1% 30.0%n -折叠折叠 11.9% 43.0%n自由卷曲自由卷曲 33.0% -n -转角转角 19.0% -53n成核-多聚化模型 prpc和prpsc处于热力学平衡，而prpsc单体不稳定，聚集在一起后变得稳定。 prpsc聚集体通过结合prpsc单体促进prpc的转化，使平衡向生成致病型构象的方向移动。在这个过程中具有传染性的物质是prpsc的多聚体，限速步骤是形成作为种子进一步稳定的prpsc的核

23、。3.2prpc如何转变成如何转变成prpsc？ 54n模板辅助转化模型 prpsc在热力学上比prpc更稳定，但prpc 转变为prpsc时要克服能垒。在没有prpsc存在时，prpc 转变为prpsc的速度很慢；在prpsc存在时，它与prpc的结合降低了转变所需的活化能，使prpsc迅速增长。prpc如何转变成如何转变成prpsc？ 554、蛋白质设计、蛋白质设计dna重组和多肽合成技术的发展使我们能够按照自己的意愿设计较长的多肽链。但由于我们无法了解这一多肽将折叠为何种构象，从而无法按照自己意愿设计我们需要的、具有特定功能的蛋白质。 对于蛋白质相互作用、配体与蛋白质的作用等结构与功能关

24、系的研究也有赖于蛋白质折叠机制的阐明。 56六、蛋白质的稳定性571.研究意义和支撑技术n意义n为研究蛋白质的热力学定律提供理论基础n蛋白质医药、食品工程产业有巨大的应用前景n支撑技术n差异扫描量热法n定点突变582.定义n蛋白质的稳定性是指作用力的净余额，它决定着一个蛋白是处于天然构象还是处于变性状态。n蛋白质的稳定性主要指蛋白质的物理上（热力学）的稳定性，而不是化学稳定性。59化学稳定性n化学稳定性主要指由于键的断裂而使结构的完整性丧失n天冬酰胺和谷胺酰胺的去氨基化n低ph值下精氨酸的水解n高温下蛋氨酸的氧化n二硫键的断裂n中性ph值下二硫键的交换n硫醇催化的二硫键的交换或者半胱氨酸残基的

25、氧化603.蛋白质的稳定性n蛋白质的稳定性即天然和变性状态下自由能的差。 dg = gn - gu = -rtlnkn天然态下自由能（ gn ）的减少和变性态下自由能（ gu ）的增加都会导致dg的减小 k = n/u = fn/(1- fn)61折叠状态的稳定性n单体蛋白折叠的稳定性一般在5 - 10 kcal/moldg = gn - gu = -rtlnkk=e-dg/rt = e-10 x1000/(2x298) =2x 10 7n室温下液体溶液中折叠状态的蛋白质和非折叠的蛋白质的比例是2x 10 7 : 1!62折叠状态的稳定性nk作为一个平衡常数，蛋白折叠的速度常数（kf）和蛋白去

26、折叠的速度常数（ku）之比。k=kf/kun如果一个蛋白自发折叠的速度常数是1 s-1（kf = 1 s-1 ），那么这个蛋白自发去折叠的速度常数大约为10-7 s-1，半衰期大约为0.693/10-7 s = 80 daysn表明去折叠的蛋白只是瞬间存在的n研究去折叠态就需要用urea, ph, etc等来打破平衡634.打破折叠平衡的方法n极端ph使蛋白变性n变性剂n温度变性644.1极端ph使蛋白变性n高ph或者低ph可以使大部分蛋白变性n大量离子进入蛋白质的内部而出现斥力减弱了疏水作用进而导致蛋白质的部分去折叠。n特异离子键的出现导致蛋白质处于一些紧密的中间态如熔球态。654.2变性剂

27、蛋白质在变性剂溶液中的稳定性：scn- cl- urea so4 2-rnase: guscn = 0.3m, guhcl = 0.8 m, urea = 3 m 打破疏水相互作用和氢键（支链和主链）664.3温度变性 n温度对蛋白结构的影响可以分为两种，热变性和冷失活。n温度变性主要影响是破坏氢键和增加疏水性。675.研究稳定性的方法n一切可以区别折叠和去折叠状态的方法n光吸收 (e.g. trp, tyr) ncdnnmr ndscn尿素梯度电泳 通过 f 和 u状态下迁移率的改变n催化活性686.支撑技术n差异扫描量热法n定点突变69热容量系统在某一过程中，温度升高（或降低）1所吸收（或

28、放出）的热量叫做这个系统在这个过程中的“热容量”。n热容量与温度变化有关，还与体系的状态转变有关，因此也与蛋白质折叠和去折叠相关。非折叠态的热容量要比折叠态的蛋白质的热容量要大。 cp = h/t = ts/tn天然态和非天然态中水有序结构的转变导致了蛋白质热容量的改变。706.1差示扫描量热法 量热实验：以恒定的速率加热两个量热池，一个量热池装蛋白质溶液，另一个量热池装缓冲液作对照，为了保持两个量热池的温度相等分别加热，它们热量需求的差别就是两个池中热容量的差别。差示扫描量热法(differential scanning calorimetry;dsc)是一种热分析法。在程序控制温度下，测量

29、输入到试样和参比物的功率差（如以热的形式）与温度的关系。差示扫描量热仪记录到的曲线称dsc曲线，可以测定多种热力学和动力学参数。 71差异扫描量热法 (dsc)ndsc measures the heat required to raise the temperature of the solution of macromolecules relative to that required to the buffer alone .ndsc can be used to directly measure the enthalpy and melting temperature of a thermally induced transition.at tm (50% unfolded),dg = 0, dh = tds72vant hoff焓dg = gn - gu = -rtlnkdg =dh -t d s-rtlnk =dh -t d slnk = (- dh/r)(1/t)+ d s/ry=mx+bvant hoff 曲线 (lnk vs. 1/t)可以从平衡常数随温度的变化关系中得到蛋白质热变性的vant hoff 焓。73发现中间体n与蛋白质折叠相关的焓有两个：n通过平衡常数算得的vant hoff 焓， dhvhn通过量热法获得的量热焓，dhcaln如