内蒙古大学生物技术 基因工程大实验开题报告

1、学号00811047 内蒙古大学生命科学学院生物系基因工程实验室本科基因工程大实验开题报告论文题目： 纳豆激酶基因表达载体的构建 及在大肠杆菌中的表达 学生姓名： 燕孟娇 年 级： 2008 专 业： 生物技术 指导教师： 苏慧敏 2011年 8 月7 日学生姓名张婷民族汉性别女出生年月1990年8月论文题目纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达开题时间2011年8 月1日结题时间2011年 8月7 日项目来源本科生基因工程大实验课一、立论依据“纳豆激酶基因表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达”项目的选题和研究的意义，国内外研究现状及发展趋势分析，主要参考文献及出处：纳豆激酶(natto

2、kinase简称NK)是一种枯草杆菌蛋白激酶，是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilisl natto)产生的一种丝氨酸蛋白酶。纳豆激酶(NarroKunase，NK)由食品纳豆中提取或纳豆菌发酵生产，是一种分子量远远小于 UK、SK、tPA的蛋白质，并可由肠道，吸收，纳豆激酶的体外、体内溶栓性质通过实验也已得到确定，同时得出纳豆激酶的体内溶栓活性为纤溶酶的四倍，在体内作用迅速、持续时间长，还能激活体内的tPA，使之温和、持续地提高血液的纤溶活性。纳豆激酶的物理、生化特点： 1)纳豆激酶是在纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilisl natto

3、)产生的一种丝氨酸蛋白酶（单链多肽酶），分子量为27728道尔顿。 2)纳豆激酶在温度超过50时迅速变性失活，但反复冻融对其影响不大。 3)纳豆激酶在PH值从7升至12时，10min内稳定；PH值低于5时，迅速变性失活。胃酸环境中的PH值只有1.2到2之间，纳豆激酶根本无法通过。4)纳豆激酶与粘性物质混合后，在PH值2-3的酸性环境中，还能保持不超过7.5%的活性。 5)纳豆激酶是大分子的单链多肽酶，可被肠道消化液（糜蛋白酶、胰蛋白酶、小肠液等）分解成氨基酸片段或分子量更小的肽链。同其它生物活性物质一样，纳豆激酶的分秘表达受多种因素的影响。纳豆激酶基因在体外转录有两个启动位点，之间被15个核苷

4、酸隔开；体内转录也在这两个位点或其附近。下游位点(P：)具有一个独特的d”识别序列。Moran等人对该基因的d”启动子和其它两种枯草芽孢杆菌的d”启动子做了比较，比较了它们的保守碱基序列，在一35区P：启动子的共有序列为5个碱基；在一10区共有序列为8个碱基两区之间被15个碱基隔开。另外两个碱基区可能调节该基因的表达一个是在启动子上游35bp处的二分体对称区，另外就是mRNA 上核糖体结台位点，mRNA 上核糖体结台位点序列为：pppAAAAG一0 0 A_0 00 U。 此外在纳豆激酶基因的105-336bp处编码了一段有77个氨基酸的蛋白肽(pmpeptide)，其有可能参与调节纳豆激酶的

5、活性。纳豆激酶的表达同其它枯草杆菌蛋白酶一样受葡萄糖阻遏和被许多SpoO 孢子形成突变株阻断，另外Cat A、hpr、Scoe突变株位点可以提高其表达。参考文献1谢秋玲,孙奋勇,廖美德,张玲,汪炬. 纳豆激酶原基因的克隆及表达J华南理工大学学报(自然科学版), 2002, (06).2 朱立成,张耀洲. 纳豆激酶原核表达纯化及多克隆抗体的制备J浙江大学学报(理学版), 2006, (04) .3 Hong-Bo Hu,Shan-Jing Yao,Le-He Mei,Zi-Qiang Zhu,Byung-Ki Hur. Partial purification of nattokinase fr

6、om Bacillus subtilis by expanded bed adsorptionJ Biotechnology Letters, 2000,22, (17) .4 付利，杨志兴.纳豆激酶的研究与应用J,生物工程进展.1995,15(15):46-49.5陈丽娟,沙长青,任永春等.纳豆激酶溶解血栓机制J,中国生物工程杂志,2003,23(4):53-56.6 丁贵平,蔡正森,王正刚.纳豆激酶的分离纯化及生化研究J,氨基酸和生物资源,2001,23(3):13-16.7 闫达中，许芳，李洁.纳豆激酶基因克隆及其在大肠杆菌中活性表达研究J,湖北大学学报（自然科学版）,2003,25(1

7、):69-72.8 NaKamura T, Yamagata Y, Ichishima E J. Nucleotide sequence of the subtilisin NAT gene, aprN of Bacillus Subtilis(natto)J.Biosci Biotech Biochem,1992, 56(11):1869-1871.二、实验方案1 实验内容和实验目标，拟解决的关键问题：1.1实验内容：、PCR扩增NK。、将NK PCR产物与克隆载体pMD19-T连接成过渡质粒。、连接pET-trx与NK，构建表达载体pET-trx-NK。、转化E. coli BL21(DE

8、3)，IPTG诱导表达、SDS-PAGE鉴定。1.2实验目标：、学习基因工程的基本研究方法。、熟悉基因工程常规仪器的使用。、培养基因工程研究的严密逻辑和科学理念。、建立做好原始实验记录的习惯。1.3拟解决的关键问题：、PCR扩增NK。、过渡质粒以及表达载体的构建。、感受态细菌的转化。、在E. coli BL21(DE3)中诱导表达NK。、SDS-PAGE检测表达蛋白。2 实验思路、方法、技术路线、实验方案及可行性分析：2.1、实验思路及方法：2.1.1、PCR扩增NKPCR引物： NK 上游 5-GGATCCGCGCAATCTGTTCCTTATGGC-3 BamH I NK 下游 5-GAAT

9、TCTTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG-3 EcoR I PCR产物大小：837bpPCR条件:94变性30s，60 退火30s，72 延伸30 s2.1.2、NK的亚克隆将NK PCR产物与pMD19-T连接过夜，构建pMD19-T-NK过渡质粒，然后将其转入DH5感受态菌中。2.1.3、表达载体的构建EcoRI和BamHI双酶切pMD19-T-NK过渡质粒和表达载体pET-trx，回收NK片段和pET-trx，连接pET-trx与NK，构建表达载体pET-trx-NK。2.1.4、诱导表达目的蛋白将pET-trx-NK转化E. coli BL21(DE3)，IPTG诱导表达，并用

10、SDS-PAGE鉴定。2.2、技术路线提质粒pMD1-T-NK、pET-trx。PDU/PDLpMD19-TPCR扩增NKpET-trxpMD19-T-NKEcoRI和BamHINKpET-trx连接连接pET-trx-NKDH5a感受态菌pET-trx-NKBL21(DE3)感受态菌BL21(DE3)感受态菌IPTG诱导表达SDS-PAGE检测3. 实验进度（10天之内）：第一天下午：讲解仪器，发放移液器等，灭菌（摇菌试管、培养皿），摇pET-trx、pMD18T-NK,配置培养基第二天上午：提质粒pET-trx、pMD18T-NK下午：PCR扩增NK，与pMD19-T连接过夜；倒平板，要D

11、H5第三天上午：作感受态DH5，EcoRI和BamHI双酶切pET-trx下午：pMD19-T-NK连接液转化DH5涂板；回收pET-trx第四天上午：七点挑pMD19-T-NK平板克隆，摇菌8-10h下午：七点提质粒pMD19-T-NK第五天上午：EcoRI和BamHI双酶切pMD19-T-NK验证；回收NK下午：NK与pET-trx连接过夜第六天上午：七点pET-trx-NK连接液转化DH5，涂板下午：挑pET-trx-NK克隆，摇菌；摇BL21第七天上午：做感受态BL21,提质粒pET-trx-NK下午：Hind酶切验证；转化BL21，涂板过夜第八天上午：七点摇菌（包括空BL21）；练习

12、组装SDS电泳模具下午：OD600=0.5时，诱导表达3h，离心集菌第九天上午：灌胶加样电泳2-3h，染色45min,脱色下午：观察脱色胶，转入清水，照相4. 预期实验成果：SDS-PAGE检测蛋白表达可观测到大小约为33-40KD的蛋白质大量表达。5. 曾参与与本实验有关的学习和研究工作积累以及已取得的工作成绩：（学过基因工程课程、读过相关的文献、写过有关的综述、参加过相关的实验设计或研究课题、获得过相关的学术奖励情况等）曾学过基因工程等相关课程。6. 请运用已学过的课堂知识结合看过的有关研究文献，提一个你认为适合本科生基因工程实验课教学的基因工程大实验方案DREB转录因子对干旱、高盐和低盐下逆境诱导基因表达起重要作用。本方案拟将DREB