细胞生物学：Chapter2 细胞生物学研究方法

1、1Chapter 2 细胞生物学研究方法细胞生物学研究方法22.1 显微成像技术显微成像技术2.2 细胞化学技术细胞化学技术2.3 细胞分选技术细胞分选技术2.4 细胞工程技术细胞工程技术2.5 分离技术分离技术2.6 分子生物学方法分子生物学方法纲纲 要要32.1 显微成像技术显微成像技术2.1.1 光学显微镜光学显微镜 焦距焦距(focal length)(focal length)：是透镜的中心平面到：是透镜的中心平面到焦点的距离焦点的距离 。4 角孔径角孔径(angular aperture)(angular aperture)：是光从样品进入显微是光从样品进入显微镜的物镜半角镜的物镜

2、半角，因此角孔径实际表示有多少光离开样品，因此角孔径实际表示有多少光离开样品通过透镜，通过透镜， 最好的光学显微镜的角孔径大约是最好的光学显微镜的角孔径大约是7070度。度。 5r=0.61/ n sin 其中：其中：n=聚光镜和物镜之间介质的折射率聚光镜和物镜之间介质的折射率, 空气为空气为1, 油为油为1.5;=样品对物镜角孔径的半角样品对物镜角孔径的半角=照明光源的波长。照明光源的波长。0.61是一个恒定的参数是一个恒定的参数分辨率分辨率(resolution, r) ：显微镜或人眼在显微镜或人眼在25 cm明视距离处，明视距离处，能清楚分辨被检物体细微结构最小间隔的能力能清楚分辨被检物

3、体细微结构最小间隔的能力 。 r值越小，分辨能力越高。值越小，分辨能力越高。 波长越短，分辨能力越高。波长越短，分辨能力越高。 6波波长长与与分分辨辨率率7分辨极限分辨极限(limit resolution)一般地说，一定波长的射线不能用以探查比它本身波长一般地说，一定波长的射线不能用以探查比它本身波长短得多的结构细节，这是一切显微镜的一个基本限度。短得多的结构细节，这是一切显微镜的一个基本限度。对可见光（对可见光（0.40.7 m ）来说，能清楚地分辨出相邻）来说，能清楚地分辨出相邻两点之间的最小间隔是两点之间的最小间隔是0.2 m。放大率放大率(magnification) 最终成像的大小

4、与原物体大小的比值称为最终成像的大小与原物体大小的比值称为放大率放大率。8 2.1.2 常用光学显微镜常用光学显微镜 普通双筒显微镜普通双筒显微镜 (binocular microscope) 荧光显微镜荧光显微镜 (fluorescence microscope) 相差显微镜相差显微镜 (phase contrast microscope) 暗视野显微镜暗视野显微镜(dark field microscope) 倒置显微镜倒置显微镜(inverted microscope)9普普通通光光学学显显微微镜镜10荧光显微镜荧光显微镜(fluorescence microscope) 荧光显微镜以荧

5、光显微镜以紫外线紫外线为光源照射被检物体，为光源照射被检物体， 使之使之发出发出荧光荧光，然后在显微镜下观察物体的形态及其，然后在显微镜下观察物体的形态及其所在位置所在位置。 要求要求：被检物体发荧光（自发荧光、诱发荧光）：被检物体发荧光（自发荧光、诱发荧光） 用途：用途：用于研究细胞内物质的吸收、运输及化学用于研究细胞内物质的吸收、运输及化学物质的分布和定位等。物质的分布和定位等。1112荧光显微镜照片（荧光显微镜照片（微管微管呈绿色、呈绿色、微丝微丝红色、红色、核核蓝色）蓝色）图片来自/ 13Laser scanning confocal mic

6、roscope1415相差显微镜相差显微镜(phase contrast microscope) 优点优点：能够观察：能够观察无色、透明、活细胞无色、透明、活细胞中的结构。中的结构。 特点特点：能将物体本身的相位差（光程差）转换为振幅（光：能将物体本身的相位差（光程差）转换为振幅（光强度）变化的显微镜。强度）变化的显微镜。16实验原理实验原理 波长波长( (颜色颜色) ) 振幅振幅( (亮度亮度) ) 相差相差( (看不见的看不见的) ) 相差显微镜的相差显微镜的环状光栏环状光栏和和相板相板(phase plate)(phase plate)能使活能使活细胞或末经染色的标本中各部分的折射率或厚

7、度的微小差细胞或末经染色的标本中各部分的折射率或厚度的微小差异，产生相位差，然后利用光的衍射和干涉的原理，把异，产生相位差，然后利用光的衍射和干涉的原理，把相相差变成振幅差变成振幅( (明暗明暗) )之差之差，使人的肉眼能够辨认出来。，使人的肉眼能够辨认出来。17环状光阑环状光阑相板相板1819暗视野显微镜暗视野显微镜(dark field microscope) 利用特殊的聚光器使照明光线不能进入物镜被放利用特殊的聚光器使照明光线不能进入物镜被放大，在黑暗的背景下呈现明亮的像。这种特殊的大，在黑暗的背景下呈现明亮的像。这种特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高。照明方式，使反差增大，分辨率提

8、高。 用途用途：用以观察：用以观察未经染色未经染色的的活体或胶体粒子活体或胶体粒子。 特点特点：主要观察的是物体的轮廓，分辨不清内部：主要观察的是物体的轮廓，分辨不清内部的微细结构。的微细结构。2021倒置显微镜倒置显微镜(inverted microscope) 物镜物镜与与照明系统照明系统的位置颠倒过来。的位置颠倒过来。 物镜置于载物台之下，物镜置于载物台之下， 光源位于载物台的上方。光源位于载物台的上方。 集光器与载物台之间的工作距离提高，集光器与载物台之间的工作距离提高， 可以放置可以放置培养皿、培养瓶等容器培养皿、培养瓶等容器， 直接对培养的细胞进行直接对培养的细胞进行照明和观察。照

9、明和观察。 22232.1.3 2.1.3 光学显微镜的样品制备光学显微镜的样品制备 1. 样品的固定样品的固定(fixation) 目的目的: : 做法做法: : 固定液：固定液：快速杀死细胞，稳定细胞的化学成份，并且使样品快速杀死细胞，稳定细胞的化学成份，并且使样品硬化以便在进一步的处理和切片时不会受到破坏。硬化以便在进一步的处理和切片时不会受到破坏。将样品将样品浸泡在固定液浸泡在固定液中。固定使得大分子交联而保中。固定使得大分子交联而保持在一定的位置上，不致于在以后的染色等处理过持在一定的位置上，不致于在以后的染色等处理过程中移位或丢失而产生人工假象。程中移位或丢失而产生人工假象。一般用

10、具有缓冲作用的一般用具有缓冲作用的醛类醛类固定液，用固定液，用甲醛或戊甲醛或戊二醛二醛作固定剂，能够与蛋白质的游离氨基形成共作固定剂，能够与蛋白质的游离氨基形成共价键，从而将邻近的蛋白质分子牢固地交联在一价键，从而将邻近的蛋白质分子牢固地交联在一起。起。 242. 2. 包埋和切片包埋和切片(embedding and sectioning)(embedding and sectioning) 包埋：通常用包埋：通常用液态的石蜡或树脂液态的石蜡或树脂做包埋剂，使之渗入整块做包埋剂，使之渗入整块组织，使之硬化成固体的包埋块。组织，使之硬化成固体的包埋块。 切片机切割包埋块，制备成薄切片。适用于光

11、学显微镜观切片机切割包埋块，制备成薄切片。适用于光学显微镜观察的切片厚度为察的切片厚度为 l l10 m10 m。253. 染色染色(staining) 目的：给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征。目的：给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征。 苏木精苏木精(hematoxylin)：核酸：核酸 伊红伊红(eosin)：细胞质：细胞质 苏丹染料苏丹染料(Sudan dyes)：脂肪：脂肪264. 放射自显影放射自显影 用感光胶片测定细胞内某种被放射性标记的物质在细胞固用感光胶片测定细胞内某种被放射性标记的物质在细胞固定时所在的位置。定时所在的位置。 272.1.4 电子显微镜电子显微镜(elec

12、tron microscope)1. 透射电子显微镜透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM) 让电子束穿透样片而成像。让电子束穿透样片而成像。 28Transmission Electron Microscope 29302. 扫描电子显微镜扫描电子显微镜(scanning electron microscopy，SEM) 用用二次电子二次电子成像来观察样品的成像来观察样品的表面表面结构。结构。 31Scanning Electron Microscope 3233Lymphocyte viewed through a TEM and a SE

13、M. (a) This TEM shows a thin slice of a lymphocyte, a type of white blood cell. This type of microscopy allows one to see the internal structures present in the slice. (b) In a SEM, surface structures can be seen ,as demonstrated in this view of a lymphocyte.Note the three-dimensional appearance of

14、this cell,in contrast to the two-dimensional appearance of the cell in(a)342.1.5 电子显微镜的样品制备电子显微镜的样品制备 与光镜相比，组织固定的特殊要求：与光镜相比，组织固定的特殊要求： 样品要薄，制成样品要薄，制成50100nm的超薄切片。的超薄切片。 保持样品的精细结构。保持样品的精细结构。 样品要具有一定的反差。样品要具有一定的反差。 电子显微镜的样品切片最后被放置在电子显微镜的样品切片最后被放置在载网载网上而上而不是玻片不是玻片上。上。 35染色染色(Stainning)醋酸双氧铀醋酸双氧铀： 可与细胞内

15、大多数分子结合，染核可与细胞内大多数分子结合，染核酸和蛋白质，但对膜的染色效果较差。酸和蛋白质，但对膜的染色效果较差。柠檬酸铅柠檬酸铅：核蛋白及糖元结合，也可大大提高细：核蛋白及糖元结合，也可大大提高细胞膜系统与物质的反差。胞膜系统与物质的反差。361.负染色负染色(negative stainning) 用重金属作染色剂，对铺展在载网上的样品进行染色，使用重金属作染色剂，对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。由于电子密度高的重金属盐包埋了样品中低有染料沉积。由于电子密度高的重金属盐包埋了

16、样品中低电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差。电子密度的背景，增强了背景散射电子的能力以提高反差。这样，在图像中背景是黑暗的，而未包埋的样品颗粒则透这样，在图像中背景是黑暗的，而未包埋的样品颗粒则透明光亮，这种染色称为负染色。明光亮，这种染色称为负染色。372. 2. 喷镀技术喷镀技术 是电子显微镜中一种重要的增强背景和待观察样品反差的是电子显微镜中一种重要的增强背景和待观察样品反差的方法。方法。 383.冰冰冻冻蚀蚀刻刻技技术术39电镜与光镜的比较电镜与光镜的比较 显微镜显微镜分辨本领分辨本领光源光源透镜透镜真空真空成像原理成像原理LMLMTEMTEM200200nmnm100

17、nm100nm0.1nm0.1nm可见光可见光（400-700400-700） 紫外光紫外光（约（约200200nm)nm)电子束电子束（0.01-0.01-0.90.9）玻璃透镜玻璃透镜石英透镜石英透镜电磁透镜电磁透镜不要求真空不要求真空不要求真空不要求真空要求真空要求真空1.331.33x10 x10-5-51.33x101.33x10-3-3PaPa利用样品对光的吸收形利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差和透射形成明暗反差40显微结构（显微结构（microscopic structuremicroscopi

18、c structure）：）：光镜下光镜下所见到的物体结构。所见到的物体结构。超微结构（超微结构（ultrastructureultrastructure）: :又称为亚显微结又称为亚显微结构。是在光学显微镜下观察不到而只能在电子构。是在光学显微镜下观察不到而只能在电子显微镜下观察的结构。显微镜下观察的结构。412.2 2.2 细胞化学技术细胞化学技术 酶细胞化学技术酶细胞化学技术：通过酶的特异细胞化：通过酶的特异细胞化学反应来显示酶在细胞内的定位。学反应来显示酶在细胞内的定位。 免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术：利用免疫反应定位：利用免疫反应定位组织或细胞中抗原成分分布的一类技术组织或细胞中

19、抗原成分分布的一类技术。 免疫荧光技术免疫荧光技术 免疫电镜免疫电镜42Figure 9-16. Indirect immuno-cytochemistry. This detection method is very sensitive because the primary antibody is itself recognized by many molecules of the secondary antibody. The secondary antibody is covalently coupled to a marker molecule that makes it readi

20、ly detectable. Commonly used marker molecules include fluorescent dyes (for fluorescence microscopy), the enzyme horseradish peroxidase (for either conventional light microscopy or electron microscopy), colloidal gold spheres (for electron microscopy), and the enzymes alkaline phosphatase or peroxid

21、ase (for biochemical detection). 43过氧物酶体过氧物酶体过氧化氢酶过氧化氢酶442.3 细胞分选技术细胞分选技术(cell sorting) 细胞分选：细胞分选： 用用流式细胞仪流式细胞仪（flow cytometerflow cytometer， FCMFCM）对）对细胞或染色体进行分选，并进行定量分析。细胞或染色体进行分选，并进行定量分析。 45细细胞胞标标记记46流流式式细细胞胞术术干涉干涉荧光荧光荧光标记细胞收集器荧光标记细胞收集器非荧光标记细胞收集器非荧光标记细胞收集器无细胞液滴收集器无细胞液滴收集器超声波振荡器超声波振荡器47染染色色体体标标记记48染染色色体体分分选选流式细胞仪流式细胞仪492.4 细胞工程技术细胞工程技术细胞工程：细胞工程：应用细胞生物学的原理和方法，结合工应用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们的设计，改变细胞内遗传物程学的技术手段，按照人们的设计，改变细胞内遗传物质以获得新型生物或特种细胞的一门综合性科学技术。质以获得新型生物或特种细胞的一门综合性