健康食品之‘改善过敏体质’功能方法

1、健康食品之It助整遇敏ft留功能押估方法960712南署食字第 0960403113 虢公告、广.、.壹、前言健康食品的轴助调整谩敏功能押估，是减少谩敏免疫反鹰之功能押估。所 耨降低谩敏免疫反鹰，金性寸不同谩敏型式有各槿谩敏反J#的指襟，例如：降低血清谩敏 抗醴含量、降低彝炎反鹰、减少谩敏反鹰相信繇田胞激素或介II的分泌、SffiT系田胞分泌系田胞激素、降低呼吸阻力等。但必i(在不影簪正常免疫反鹰的情况下，封谩敏指襟有减 1ft作用，封健康才有助益。若以勤物可以谩敏原致敏勤物，再迤行抗原特昇性免疫 反鹰的押估。至於人醴的改善谩敏的押估，可由正常人奥谩敏向的人分别迤行。贰:、方法一、勤物勤物：建

2、I®!用小鼠，常用的 Balb/c或是B6小鼠皆可，6-8遇大，雄鼠或雌 鼠皆可，每黜堡数悬罩一性别至少10H。(一)致敏小鼠本勤物之谩敏免疫反鹰是以腹腔注射谩敏原的模式迤行，探用谩敏原作悬抗原,可以氢氧化金目作悬佐剜(adjuvant),在注射抗原前及注射抗原一遇彳爰以眼窗探血，取得血 清迤行抗原特昇性抗H渡度之分析，碓立勤物谩敏模式之建立，必要畤i(致敏三至四次。 封於呼吸道谩敏之勤物模式，宜另以喧露致敏法使优呼吸道接斶谩敏原，鼻腔谩敏之勤 物模式宜以鼻腔接斶谩敏原等各槿不同谩敏勤物模式。1 .血液抗H滤度(1)可利用 sandwich-ELISA 免疫呈色反J#法或 Radia

3、l immunodiffusion (RID)法，定量血 清中免疫球蛋白IgE、IgG、IgM、IgA和抗醴含量利用免疫呈色反鹰法测定免疫球蛋白滤度：符血清加入表面已覆盖免疫球蛋白抗H 的96孔篮中，静置反彳爰，再加入襟有呈色酵素的抗醴作用，最彳爰加入呈色剜典襟 型信封照，系墨由可见光吸光测定分析言十算便可以算出免疫球蛋白渡度。RID方法悬：符血清放入培餐孔中，静置 24至48小畤彳爰，再测量其直彳至大小，典 襟型信封照，算出免疫球蛋白渡度。谩敏原的特累性抗醴筐生利用免疫呈色反鹰法测定抗原特巽性免疫球蛋白滤度：符血清加入表面已覆盖谩敏抗原的96孔黑中，静置反鹰彳爰，再加入襟有呈色酵素的抗老鼠I

4、gE、IgGi或等抗醴作用， 最彳爰加入呈色剜典襟型信封照，由可见光吸光测定分析言十算便可以算出免疫球蛋白 渡度。2 .脾麒或是淋巴结余田胞增生反鹰余田胞增生能力即指免疫系田胞受到刺激畤，能黄J增生的能力。故增生能力之表示，以添加裂殖素彳爰，系田胞增生的数值悬未添加裂殖素畤数值的倍数，耦悬增 生指数(Stimulation Index), MW S. I.。本的系田胞增生的刺激物须包括谩敏原和裂殖素， t aw生a以谩敏原刺激培餐， 另可使用如ConA、PHA等裂殖素或抗CD3抗醴的刺激膏I,以分析T 胞的增生反J®。 B系田胞i(以谩敏原刺激培餐，另可使用如 LPS来刺激，分析B系

5、田胞的增生反鹰。迤行步骤：1 1) 3H-thymidine 嵌入法本方法敕索敏，符脾IB田胞 2x 106/ml置於96孔黑，再加入RPMI培餐基或分别 添加有LPS、Con A、PHA等系田胞裂殖素的培餐基。於 37c二氧化碳瓢菌培餐箱培餐 雨天彳爰，加入1iCi/well 3H-thymidine,么ft8培餐20小畤彳爰，以系田胞收集倭收集系田胞 的彪氏上，滤纸凰乾彳以即粉十和兼测 3H-thymidine含量，言十算系田胞增生能力。2 2) MTT 法MTT的测定方法，是利用余田胞本身的酵素封受II的作用，生IS色的建化，再迤 一步测定其吸光值。如果系田胞受到系田胞裂殖素的刺激，增生

6、越多，JW活的系田胞愈多，酵 素的活性就曾敕高，可以测到敕高的吸光值。利用此一原理，也可以来测定系田胞的增殖 反鹰，但是此槿测定方法通常封附著性系田胞的型碓度敕高，封熟浮性系田胞JW敕不理想， 系田胞数典吸光值的直相有鲍和？I象，吸光值瓢法代表系田胞数值，以致敕不索敏，迤 行本畤鹰特别注意。(3)螯光流H言十数倭来测定DNA的染色利用螯光染色的方法来分析系田胞是否受到刺激，系田胞核内的DNA是否有任何建化, 可以利用bromodeoxyuridine (BrdU)的方法来染色。BrdU的方法刖需要再加上一(0抗 BrdU的覃株抗醴加上螯光，才能利用螯光流H言十数H来加以分析。悬了迤一步分析是

7、那些系田胞的DNA有增加的建化，可以同畤封道些系田胞迤行表面襟言己的分析。如利用抗 CD3及抗B220抗醴先行染色，再符系田胞加以固定，然彳爰迤行DNA的染色。拣田胞的表面襟言己及系田胞内的DNA螯光使用不同波辰的螯光，以便能别在倭器上能封造雨群不 同的系田胞迤行分析。如果能别连到此一目的，便能别不需要符系田胞分离隹出就可以知道是那些余田胞受到活化。3 .系田胞激素分泌符分离隹出的淋巴球以5x106/ml的滤度置於24-孔篮中，利用已定量谩的谩敏原、 Con A或抗CD3抗H来刺激适些淋巴球。24到48小畤的培餐彳爰，符上唇液高隹心下 来，以测定其余田胞激素裂造的量。在取得足别横醴以前，可符其

8、它横醴先保存在-70C, 等到梅Til足额J畤冉一起浏就。系田胞激素的测定是利用sandwich-ELISA法。先聘抗余田胞激素的抗醴先覆盖在24-孔篮上，在4静置一晚，在迤行前先以1% PBS-BSAJ8 理清洗去多绘抗H。再加入测定的檬品至24-孔胎 於室温2小畤彳爰加入biotin睹的抗余田胞激素抗®1。雨小畤的室温静置彳爰，加入 avidin睹氧化酵素(avidin-linked peroxidase),再静置二他I小畤彳爰加入受U以呈色。上述的裂殖素的浸度及刺激畤IW在 瞬迤行之前都鹰先测定其最逾常的渡度，或以已知渡度的系田胞激素作悬封照。4 .呼吸道肺冲洗液之分析(1)彝

9、炎系田胞数量及槿分析，如：嗜伊缸性白血球、中性白血球、罩核球及淋巴球等樱牲鼠堡彳爰，剪H氟管露出小洞，以IM原置留管插入氟管，软管绑聚彳爰，以生理食 亶水冲洗肺部5次，回收肺冲洗液放入雕心管高隹心，取上清液保存待分析。下唇系田胞以 含BSA生理食St水溶系墨trypan blue dye exclusion法染色，以余田胞H嗷器言十算所有存 活白血球数目。装置好玻片彳爰，取余田胞液置於cytospin高隹心管，cytospin彳爰取下载玻片JM乾，取Liu A染剜染色30秒，优背面以水青KB中去多绘染膏I, JM乾，取 Liu B染剜染 色60秒，再冲去多绘染剜，凰乾，(察染色成果。以阿拉伯月

10、蓼封片，以油判It至少 五他视野之余田胞或数200(0以上之余田胞黜成，言十算判UK田胞所估余田胞之数目。(2)彝炎相介U分析，如：黜胺、系田胞激素及超化激素黜胺可以HPLC方法分析，唯檬品中黜胺回收率敕低，目前黜胺定量多以 市售的黜胺测定剜黜分析。系田胞激素典超化激素分析方法如前所述。5 .肺功能测定或其他谩敏相有效之指襟测定(1)氟喘疾病模式：呼吸道阻力、呼吸敏感度每堡小鼠在最彳爰一次吸入式致敏的隔天迤行肺功能测定，使用whole bodyplethysmography (Buxco)以喧11的方式依序吸入 3 分金童的 0 3.125 6.25 12.5 25 mg/mL methach

11、oline,再分另曜!|定3分金童，言己金泉肺功能指襟 Penh (Enhanced Pausejfi。 鼻炎疾病模式：打喷嚏、鼻阻力、鼻内面稹、抓鼻次数等打喷嚏、抓鼻次数等可以抗原溶液滴入小鼠鼻腔内，於滴入性致敏彳爰言十数10分金童内小鼠打喷嚏或抓鼻次数，唯此言十数方法因他人判断差累性敕大，i(多人重褪言十数。（3）其他病症：其他有效Iff估工具6 .自然毅手系田胞活性悬测定勤物之自然毅手系田胞的活性， 先培餐自然毅手系田胞的襟的系田胞（YAC-1 系田胞株）。 YAC-1系田胞典51Cr先在一起培餐余勺4小畤，符残绘在就管中的51Cr除去。 再加入不同数目的覃核系田胞典已典51Cr培餐谩的

12、襟的系田胞一起培餐，培餐一段畤彳爰 取出上清液，以丫 -counter内言十算其放射强度。在的谩程中，利用 NP-40或是HCl 符系田胞破壤，以取得51Cr的最高释放值。值背景值算公式:M00%最高释放值背景值除了上述健统方法，目前亦有以FAScan分析法，可参照所使用的相信制剜典倭器 操作流程，但i（明列数摞言十算方式典表示方法。7 .吞噬余田胞活性吞噬系田胞可以分别测定罩核球（monocyte）或是中性白血球的吞噬能力，目前可以分 别利用吞噬余田菌如E. coli或酵母菌等方法来加以测定，也可以利用已襟言己好的E. coli （如 螯光），在系田胞吞噬彳爰利用螯光流H言十数倭来加以分析。

13、二、人醴的陶床就必i（委阈内外大孥食品管餐、等相研究所、ft孥中心或其他中央衢生主管械 信在可之研究械情轨行，需有ft肺参典，或遵循衢生覃位封保健食品人Ulf瞬有之相 信在规定。人111a瞬的谩敏免疫功能押估，原刖上典勤物的押估近似，惟迤行人醴的陶床就之 前谩人nia瞬委H曾通谩才能加以迤行。受者分封照黜（不吃待测檬品）、黜（分二至三黜剜量），分别在前彳爰探血 液，测定抗或分离隹周遏血液罩核系田胞，迤行以下同畤，建S!由至少一家以上 之就中心迤行瞬以求公允。（一）谩敏免疫反鹰指襟以下分析方法典勤物部分方法相同，唯i（使用分析人I®的就剜。1 .余恩IgE抗H典谩敏抗原特昇性IgE抗H

14、之测定封受就者迤行探血彳爰，血清部分可利用sandwich-ELISA免疫呈色反J#法或Radioimmunodiffusion （RID）法，定量血清中免疫球蛋白IgESS抗®!含量，建St同畤测定IgG、IgM、IgA的含量，觐其是否有所建化，分析方法如前所述。2 .谩敏抗原特昇性增生反封受者迤行探血彳爰，以Percoll梯度法分离隹得淋巴球，如前所述，以逾常渡度之 裂殖素，常见或特定谩敏原刺激彳爰，分析其余田胞增生能力。3 .谩敏抗原特累性系田胞激素分泌同前，以Percoll梯度法分离隹得淋巴球，如前所述，以逾常滤度之裂殖素，常见或 特定谩敏原刺激彳爰，收集上清液分析其余田胞激素含量。4 .周遏血液覃核系田胞分离隹培餐，迤行彝炎介II分析同前，以Percoll梯度法分离隹得淋巴球，如前所述，以逾常渡度之罩核球裂殖素， 常见或特定谩敏原刺激彳爰，收集上清液分析其樊炎介II含量。5 .樊炎系田胞言十数，如：嗜伊缸性