富铬米曲霉生工13

1、富铬米曲霉性质的研究一、 目的1. 学会用分光光度计法测定三价铬离子。2. 了解环境中各种因素对米曲霉富集三价铬的影响。3. 学习胞内多糖的提取方法以及定量测定的方法。4. 掌握菌体内CAT、SOD酶活和谷胱甘肽含量的测定方法。二、 原理铬是“中国环境优先污染物黑名单”上优先监测的重金属之一。铬的化合物中Cr6+、Cr3+毒性依次减小，金属铬可以认为无毒。用微生物方法清除环境中的铬是当前研究的热点。但微生物在环境中吸收重金属是其生理功能的一种表现，微生物在自然环境中的生长受到各种因素的影响。同样每一种微生物对各种金属元素的吸收功能受到环境因素的影响也是比较大的。为了更好地利用微生物来富集金属离

2、子，就要深入的研究微生物吸附重金属效率的影响因素。溶液中Cr3+的去除过程大致为：价键作用结合到微生物细胞表面、转移到细胞内部。谷胱甘肽广泛存在于动、植物中，在生物体内有着重要的作用。在面包酵母、小麦胚芽和动物肝脏中的含量很高，机体新陈代谢产生的过多自由基会损伤生物膜，侵袭生命大分子，谷胱甘肽具有多方面的生理功能，它的主要生理作用是能够清除掉自由基，Cr3+对米曲霉有毒性，主要表现在对生物膜的损伤，谷胱甘肽可以有效减少生物膜的损伤。真菌多糖是一种特殊的生物活性物质，它可以与金属离子结合从而降低金属离子对生物体的损伤。多糖是极性大分子化合物，溶于水，不溶于乙醇。常用的提取方法有热水浸提、稀碱液浸

3、提法、稀酸液浸提法、超声抽提法、酶提法，以及超临界流体萃取法。抗氧化酶是超氧化物歧化酶、硫氧还蛋白过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶等的统称。一旦在机体内形成过氧化物，它们即刻发挥作用，利用氧化还原作用将过氧化物转换为毒害较低或无害的物质。因此抗氧化酶活的指标是衡量米曲霉抗氧化损伤的重要指标之一。三、 材料与方法1. 菌种 米曲霉（Aspergillus oryzae）2. 试剂（1） 铬溶液（CrCl3 40g/L）：称取三氯化铬4g，溶于水并定容至100mL。（2） 磷酸溶液（1：1）：取分析纯磷酸30mL加入30mL蒸馏水。（3） 高锰酸钾溶液（40g/L）：取4克高锰酸钾固体，

4、溶于蒸馏水并定容至100mL。（4） 浓硝酸（分析纯）（5） 氢氧化钠溶液：过饱和、0.5mol/L 、1mol/L、2mol/L（6） 盐酸溶液：0.5mol/L 、1mol/L、2mol/L（7） 尿素（200g/L）：取20g尿素固体，溶于水并定容至100mL。（8） 亚硝酸钠（20g/L）：取2g亚硝酸钠固体溶于水定容至100mL。（9） 显色剂：取二苯碳酰二肼0.1g，溶于25ml丙酮，加水定容至50ml，于棕色瓶中避光低温保存。（10） 80%浓硫酸（分析纯）：取77mL 98%浓硫酸加入到23mL水中。（11） 蒽酮试剂：称取0.1g蒽酮，溶解于50mL80%硫酸中即得。（12）

5、 葡萄糖标准液（200mg/L）：准确称取110烘干至恒重的葡萄糖20.0mg，用水溶解，定容至100m1。（13） 邻苯三酚（焦性没食子酸）：用10mmol/L HCl配置成50mmol/L的溶液，新鲜配制。（14） 50mmol/L、pH 7.5磷酸钠盐缓冲液（15） 20mmol/L H2O2溶液：取227L的30% H2O2溶液，用50mmol、pH 7.5磷酸缓冲液稀释至100mL，现用现配，低温避光保存。（16） pH 8.3，50mmol/L的磷酸钠缓冲液。（17） 0.25mol/L pH 8.0 Tris-HCl缓冲溶液：称取Tris 30.2g，加入蒸馏水800mL搅拌溶解

6、，加入浓盐酸10mL，室温下调节pH至8.0，定容至1L。（18） 磷酸盐缓冲溶液：取磷酸二氢钠6.8g，庚烷磺酸钠2.2g，用磷酸调pH至3.0，加超纯水定容至1L。（19） DTNB溶液：用DTNB加0.05mol/L pH 3.0的磷酸盐缓冲溶液配成0.01moL/L的溶液，存在于棕色瓶中低温暗处备用，使用时用0.25moL/L的Tris-HCl缓冲溶液配成0.1mmoL/L的DTNB溶液。3. 培养基液体培养基： 3% 蔗糖，1.5%酵母膏，pH 6左右，装液量为250mL三角瓶装60ml 12120min灭菌。固体培养基：2%琼脂，3% 蔗糖，1.5%酵母膏，pH 6左右，12120

7、min灭菌，倒平板。4. 仪器（1）容量瓶：100mL、50mL；（2）试管；（3）三角烧瓶：100mL、250mL；（4）电炉（5）分光光度计；（6）水浴锅；（7）pH计5. 铬含量的测定原理：Cr3+与显色剂不发生显色反应，需先将Cr3+氧化成Cr6+，与二苯碳酰二肼发生显色反应，溶液呈紫红色。为了排除其他金属离子的影响，实验用水应用蒸馏水。（1）标准曲线的测定将配制好的铬标准液进行梯度稀释后，获得20 mg/L， 40 mg/L，60 mg/L，80 mg/L ，100 mg/L ，120 mg/L ，140 mg/L，160 mg/L， 180 mg/L，200 mg/L，取1.0mL

8、液体加入1.5mL磷酸溶液，后加蒸馏水至25mL，转移液体到三角瓶中并加入0.2mL高锰酸钾溶液，加热蒸发至原有体积的一半左右，冷却后加水定容至25ml。（若氧化过程中溶液褪色，补加高锰酸钾溶液使溶液保持始终紫红色）向定容后的液体中加入1mL尿素溶液，然后滴加亚硝酸钠溶液使其褪为无色（同时产生气体），静置使沉淀下沉。取5 mL无气泡上清液加入0. 5mL显色剂显色（紫红色），在540nm波长处用分光光度计测量读数。（2）三价铬含量的测定 胞内铬的测定：将培养液抽滤，得菌体，洗涤，85干燥至恒重。取菌体0.5g，加入10ml浓硝酸放置在电炉上加热消化，消化直至溶液呈清亮色，消化过程中若溶液量减少

9、，为了防止蒸干可续加硝酸直至消化结束。（消化过程要注意安全，需在做好防护措施的情况下在通风橱内进行）消化结束后先用过饱和的氢氧化钠溶液进行粗中和，再调pH至59之间。将中和后的溶液定容至25mL，剩下步骤同标准曲线的测定步骤。培养液中的铬测定：将培养液离心或过滤，取上清液或滤液，按标准曲线中的测定方法进行测定。6. 多糖含量的测定（蒽酮-硫酸法）原理：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与蒽酮缩合成一种蓝绿色化合物，在10100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在620nm波长下有最大吸收峰。（1）标准曲线的测定精密吸取葡萄糖标准液2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 ml

10、分别置于100ml量瓶中加水定容至刻度，摇匀得葡萄糖稀释液。分别取各浓度葡萄糖溶液和蒸馏水1mL注入干洁的试管中，加蒽酮试剂5ml混合之，于沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却至室温，以上述1mL水所制得的空白溶液做参比，于波长620nm处测定各溶液吸收度，以葡萄糖稀释液的浓度（g/ml）为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准曲线。（2）样品的测定发酵液抽滤得菌丝体，用蒸馏水清洗三遍后烘干至恒重，粉碎成粉末后备用。称取菌丝体粉末0.1g，于具塞试管中，加6ml 水，85热水法提取2-3h，补水至6ml，5000rpm离心10min后,上清液加入3 倍量95%乙醇，静置过夜，离心，沉淀用蒸馏水复溶，得样品

11、溶液取适当稀释的样品溶液1mL注入干洁的试管中，加蒽酮试剂5ml混合之，于沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却至室温，以水代替样品溶液反应制备参比溶液，测定OD620。7. SOD的测定原理： 在碱性条件下,邻苯三酚发生自氧化反应,生成有色物质红碚酚,同时产生O2- ,利用SOD能分解O2-的特性,阻止中间产物的积累,通过测定在特定波长下的光吸收速率计算酶的活力.(可通过调节邻苯三酚浓度调节自氧化速率)。以每分钟对邻苯三酚的光化还原的抑制50%为1个SOD活性单位。（1）邻苯三酚自氧化速率的测定在25，4.5ml 50mmol/L，pH 8.3的磷酸缓冲液中加入100l 5mmol/L的邻苯三酚，迅

12、速摇匀，倒入石英比色皿中，在325nm波长下，每隔30s测吸光度A值一次，要求自氧化速率在0.070 OD/min左右（2）酶活力测定（1）酶液制备称取菌体样品，加入5.0ml提取缓冲液，在冰水浴中研磨成匀浆，9000rpm离心5min，收集上清液，即为酶提取液。低温保存。酶活测定方法与测邻苯三酚自氧化速率相同，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液（4.4ml 50mmol/L，pH 8.3的磷酸缓冲液，加入100l酶液，加入100l 5mmol/L的邻苯三酚溶液启动反应）中，测得数据按下列公式计算酶活性。酶活（U/mL）=(0.070- A325/min)*2*样品提取液总体积/(0.07*测

13、定时所取样品提取液体积*菌体质量)8. CAT的测定原理：过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，他能催化植物体内累积的过氧化氢分解为水和分子氧，从而减少H2O2对组织造成的氧化性伤害。因此，可根据反应过程中过氧化氢的消耗量来测定该酶活的活性。（1）酶液制备称取菌体样品，置于研钵中，加入5.0ml提取缓冲液，在冰水浴中研磨成匀浆，12000 x g离心30min，收集上清液，即为酶提取液。低温保存。（2）活性测定酶促反应体系由2.9mL 20mmol/LH2O2溶液和100L酶提取液组成。以蒸馏水为参比空白，在反应15s时开始记录反应体系在波长240nm处吸光度值，作为初始值，然后每隔30s记录一次

14、，连续测定，至少获取6个点的数据。重复3次。（3）酶活计算记录反应体系在波长240nm处的吸光度值，制作OD240值随时间变化曲线，根据曲线的初始线性部分（从时间I到时间F）计算每分钟吸光度变化值OD240=（OD240F-OD240I）/tF-tI。式中 OD240-每分钟反应混合物吸光度变化值OD240F -反应混合液吸光度终止值OD240I -反应混合液吸光度初始值tF -反应终止时间，mintI -反应初始时间。然后以每克样品每分钟吸光度变化值减少0.01为1个过氧化氢酶活性单位，单位是0.01OD240/min·g。计算公式为U= （OD240 x V）/（0.01 x V

15、s x m）式中 V-样品提取液总体积，mL Vs -测定时所取样品提取液体积，mLm-样品质量，g。 9. 谷胱甘肽含量的测定原理：含巯基化合物可以与DTNB反应，断裂DTNB的二硫键产生2-硝基-5-硫代苯甲酸（NTB-），若在中性或碱性pH条件下的水中可以离子化，生成NTB2-二价阴离子。这种NTB2-离子呈现黄色。（1）GSH提取采用冻融法。精确称取湿菌体1g，加入超纯水3mL混匀，于-20冰箱中冷冻过夜，第二天沸水浴10min，取出混匀，5000r/min离心2min，取上清，即得GSH提取液。（2）DT NB 衍生-光度法测定GSH 含量(a) 标准曲线的绘制取还原型GSH 标准品

16、50 mg 定容至50mL，得到1 g /L GSH 标准溶液, 取0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.8，1.0 mL 标准溶液, 加水至1. 0 mL, 加入Tris-HCl 缓冲溶液3 mL, 混匀后取1. 0 mL 加到DT NB 溶液5 mL 中, 混匀反应5 min, 于412 nm 波长处测定吸光度, 以对照品质量浓度( g /L ) 为横坐标, 吸光度为纵坐标, 绘制标准曲线。（b）GSH 含量测定取待测样品溶液1. 0 mL, 按上述DTNB 衍生-光度法的试验方法测定吸光度, 在标准曲线上查得GSH 质量浓度( g /L ) 。10. 生物量的测定（

17、重量法）湿重：取定量滤纸两张，分别在分析天平上称重（m1、m2）。取其中一张滤纸，将培养液进行过滤，收集菌体，沥干后称重（m3），取另一张滤纸，用滤液润湿，沥干后称重m4。计算细胞的湿重。干重：将前部分湿菌体转移至已知重量的培养皿中，85烘干至恒重，计算菌体干重。11.丙二醛的测定实验原理：丙二醛（MDA）是膜质过氧化的最终产物之一,其含量高低反映了细胞膜质过氧化水平,MDA可与蛋白质结合引起蛋白质分子内和分子间的交联,使膜系统变性,进而影响细胞膜透性。在高温、酸性条件下，MDA能与硫代巴比妥酸（TBA）形成红棕色的三甲基复合物，该复合物在532nm处有最大吸收。然而，样品中存在的可溶性糖类对

18、该反应有干扰作用。糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm、532nm处也有光吸收。为消除干扰，可用下列经验公司消除由蔗糖引起的误差, C(umol/L) = 6.45 *(OD532-OD600)- 0.56*OD450（1） 实验试剂100g/L三氯乙酸（TCA）溶液、6.7g/L硫代巴比妥酸（TBA）溶液（2）测定过程称取湿重菌体1g，加入5.0mL100g/L TCA溶液，研磨匀浆后，于4、10000×g离心20min，收集上清液，低温保存备用。取3.0mL上清液，加入3.0mL 6.7g/L TBA溶液，混合后在沸水浴中煮沸20min，取出冷却后再离心一次。分别测定

19、上清液在450nm、532nm和600nm波长处的吸光度值。重复三次。 计算样品中丙二醛含量。四、 实验内容实验过程（1）菌种活化：在无菌条件下自斜面菌种挑取一环菌体，接入平板中，在30±1下恒温培养3d。（2）发酵培养：将活化后的菌体接种到发酵培养基中，振荡培养48-72h。实验一、探究不同铬浓度对米曲霉生长的影响（1）培养基的配制分别配制CrCl3浓度为0g/L，0.5 g/L，1.0 g/L，1.5 g/L的液体培养基，pH 6.0左右，每个浓度做2组平行。（2）实验步骤a、在培养菌体期间测定并绘制出三价铬标准曲线。b、液体培养基在无菌条件下自平板菌种挑取一环菌体，接入含不同铬

20、浓度的液体培养基中，在30±1下振荡培养60h。分别在12h、24h、36h、48h、60h取出培养液2mL,若有菌体，可离心获得上清液。抽测发酵液中铬的含量和总糖含量，同时测量60h培养液中的生物量和以及菌体内铬含量。实验二、铬浓度对米曲霉胞内多糖含量以及谷胱甘肽含量的影响（1）培养基的配制配制CrCl3浓度为0g/L，0.8 g/L，1.5 g/L的液体培养基，pH 6.0左右，每个浓度做2组平行。（2）实验步骤在无菌条件下自平板菌种挑取一环菌体，接入液体培养基中，在30±1下振荡培养3d，在此期间，测定并绘制出总糖和谷胱甘肽的标准曲线。在60h后取出摇瓶，抽滤，洗涤得菌体，测定生物量。a、 胞内多糖干燥称重测生物量，而后经研磨，热水抽提，醇沉复溶后制得样液，用蒽酮硫酸法测多糖含量。