第04章标记物及其与抗原抗体的结合物制备

1、第一章第一章 血液标本采集与处理血液标本采集与处理临床免疫学检验技术第四章第四章 标记物及其与抗原抗体的标记物及其与抗原抗体的结合物制备结合物制备汪汪 付付 兵兵/R20107 目 录第一节 标记物种类及特性第二节 常见交联剂的种类及特性第三节 放射性核素与抗原抗体结合物制备第四节 荧光素与抗原抗体结合物制备第五节 酶与抗原抗体结合物制备第六节 化学发光剂与抗原抗体的结合物制备第七节 稀土离子与抗原抗体的结合物制备第八节 量子点与抗原抗体的结合物制备第九节 胶体金与抗原抗体的结合物制备第一节第一节 标记物的种类及特性标记物的种类及特性重点提示放射性核素荧光物质酶和酶作用底物化学发光剂量子点胶体

2、金第一节 标记物的种类及特性标记标记免疫技术免疫技术 = = 免疫技术免疫技术 + + 标记技术标记技术 抗原抗体反应示踪标记物示踪标记物高特异性高灵敏性精密仪器检测高精密性既可以与抗原或抗体相结合，既可以与抗原或抗体相结合，又可以被相应的仪器所检测又可以被相应的仪器所检测的物质，这就是标记物的物质，这就是标记物标记物在免疫分析中标记物在免疫分析中的作用在于示踪标记的作用在于示踪标记并能够被检测并能够被检测一、放射性核素是指在自然条件自然条件下可发生自发性的转化，由一种放射性核素转变为另一种放射性核素，并同时释放射线同时释放射线，这一转变过程称为放射性衰变。依衰变方式分为：、。一、放射性核素常

3、用标记核素 125I 3H 理化性理化性 活泼活泼 差差标记方法标记方法 简单简单 复杂复杂对标记物对标记物免疫活性的影响免疫活性的影响 小小 大大射线射线 半衰期半衰期 60d 12.3y60d 12.3y测量条件测量条件 简单简单 复杂复杂放射性核素125I特点化学性质较活泼，标记方法简单，容易获取高比活性的标 记结合物；衰变过程不产生电离辐射强的射线，对标记多肽，蛋白抗原分子的免疫活性影响小；衰变过程中释放射线，可用计数器测量，方法简便，易推广应用；半衰期(60天)适中、核素丰度(95)及计数率相对较高。二、二、荧光物质荧光物质有机化合物荧光素稀土离子螯合物荧光底物（酶作用后产生荧光的物

4、质）荧光素荧光素异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）四乙基罗丹明（rhodamine, RB200）四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamine isothiocyanate, TRITC）藻红蛋白(phycoerthrin, PE)常用的荧光素特性荧光物质荧光物质最大吸收光谱最大吸收光谱最大发射光谱最大发射光谱应用应用异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素 (FITC)(FITC)490490495nm495nm520520530nm 530nm （黄绿（黄绿色）色）FATFAT、荧光偏振免疫测、荧光偏振免疫测定定四乙基罗丹明四乙基罗丹明

5、 (RB200)(RB200)570570575nm575nm595595600nm600nm（橙红色）（橙红色）FITCFITC的衬比染色或双的衬比染色或双标记标记FATFAT四甲基异硫氰酸四甲基异硫氰酸罗丹明罗丹明 (TRITC)(TRITC)550nm550nm620nm620nm（橙红色）（橙红色）FITCFITC的衬比染色或双的衬比染色或双标记标记FATFAT藻红蛋白（藻红蛋白（PEPE）490-560nm490-560nm595nm595nm（红色）（红色）双标记双标记FATFAT、流式细胞、流式细胞术术稀土离子镧系元素属于三价稀土离子，包括铕（Eu3+）、钐（Sm3+）、铽(Tb

6、3+)、钕（Nd3+）、镝（Dy3+）和铈(Ce3+)等。铕是标记抗原抗体应用最广的元素。游离的稀土离子荧光比较弱，但与适当的螯合剂如-萘甲酰三氟丙酮（-NTA）、三甲基乙酰三氟丙酮（PTA）等形成螯合物后，可使荧光得到增强。稀土离子的荧光特性荧光特性如下：具有较大的Stokes位移，发射光谱和激发光谱不会相互重叠。荧光寿命长，荧光半衰期介于10-1000s之间。激发光波长范围宽，发射光谱带很窄，甚至不到10nm。其他荧光物质其他荧光物质某些化合物本身无荧光效应，但经酶催化后便具有强荧光。如4-甲基伞酮-D半乳糖苷，受-半乳糖苷酶的作用后分解成4-甲基伞酮，可发出荧光，激发光波长为360nm，

7、发射光波长为450nm。其他如碱性磷酸酶的底物（4-甲基伞酮磷酸盐）和辣根过氧化物酶的底物（对羟基苯乙酸）等，都具有荧光底物的性质。三、酶和酶作用底物常用的酶标记物有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)- 半乳糖苷酶(-galactosidase, -Gal) 每种酶可与相应的显色或发光底物作用，产生典型每种酶可与相应的显色或发光底物作用，产生典型的有色反应物或化学发光反应，通过反应的颜色或发光的有色反应物或化学发光反应，通过反应的颜色或发光强度对被检物进行定性、定量分析强度对被检物进行定性、定

8、量分析。辣根过氧化物酶HRP辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRPHRP） 糖蛋白（主酶）糖蛋白（主酶）亚铁血红素（辅基）亚铁血红素（辅基）主酶与酶活性无关主酶与酶活性无关 辅基是酶的活性中心辅基是酶的活性中心RZRZ值：值：403nm 403nm （辅基）（辅基）与与275nm275nm（主酶）（主酶） ODOD值之比值之比 RZRZ值与酶活性无关，值与酶活性无关，酶活性单位比酶活性单位比RZRZ值值更为重要更为重要 ELISAELISA中应用最为广中应用最为广泛的标记用酶泛的标记用酶 碱性磷酸酶ALP及-半乳糖苷酶半乳糖苷酶碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（APAP） 菌源性菌源性AP AP 肠粘膜

9、肠粘膜APAP 半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（-Gal-Gal） 用于均相酶用于均相酶免疫测定免疫测定 HRP底物HRPHRP的底物的底物 DHDH2 2+H+H2 2O O2 2 D+2H D+2H2 2O O HRPHRP供氢体供氢体DHDH2 2习惯上被称为底物，底物有多种习惯上被称为底物，底物有多种 H H2 2O O2 2为受氢体，为受氢体，HRPHRP对受氢体的专一性很高对受氢体的专一性很高 邻苯二胺邻苯二胺 OPDOPD四甲基联苯胺四甲基联苯胺 TMBTMB5-5-氨基水杨酸氨基水杨酸5-ASA 5-ASA 2,2-2,2-氨基氨基- -二二(3-(3-乙基乙基- -苯并噻苯并噻唑啉磺

10、酸唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 ABTSABTS常用底物常用底物OPDOPD反应后显橙黄反应后显橙黄色，加酸终止反色，加酸终止反应后呈棕黄色，应后呈棕黄色，测定波长测定波长492nm492nm。不稳定，致癌性。不稳定，致癌性。TMBTMB反应后显蓝色反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变加酸终止反应后变为黄色为黄色, ,测定波长测定波长450nm 450nm ，稳定，无，稳定，无致癌性，致癌性，ELISAELISA中应中应用最广泛的底物。用最广泛的底物。 HRPHRP的常见底物的常见底物 对羟基苯乙酸（4-hydroxyphenylacetic acid，HPA）HPA具有荧光底物性质，在H2O2存

11、在下被HRP氧化成二聚体（荧光物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长的荧光。H2O2HRP+荧 光COOHHOCHCOOHHOCH22氧化二聚体ALP底物常用的常用的ALPALP色原底物色原底物对-硝基苯磷酸盐（p-nitrophenyl phosphate，PNP）氯化硝基四氮唑蓝/ 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐（nitro- blue-tetrazolium/5-bromo-4-chloro-3- indolyl phosphate，BCIP/ NBT）4-甲基伞形酮磷酸盐（4-methylumbelliferyl phosphate，4-MUP）是ALP的发光底物之一。

12、ALPALP的的底物底物 对对- -硝基苯磷酸酯硝基苯磷酸酯（ pNPP pNPP ）经经APAP作用后的产物为黄色对作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm405 nm。 常用底物常用底物BCIP/ NBT常用于ELISPOT中的PVDF膜显色，在ALP的催化作用下，BCIP被水解生成强反应性的产物，该产物与NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色沉淀4-MUP被AP催化生成4-甲基伞形酮，在360nm的激发光的作用下，发出450nm的荧光，可用荧光光度计进行测量。荧光AP 360nm激发光H3PO4 +- Gal 荧光底物-Gal-Gal的底物的底

13、物 4-4-甲基伞酮基甲基伞酮基-D-D半半- -乳糖苷乳糖苷（ 4MUG 4MUG ）酶作用后，生成高强度酶作用后，生成高强度荧光物荧光物 ，用荧光计测，用荧光计测量。量。常用4-甲基伞酮基-D半乳糖（4-methylumbellifery-D-galactoside，4-MUG）作为底物，酶促反应后，产生高强度荧光物质4-甲基伞形酮（4-MU）。四、化学发光剂在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物化学发光剂或发光底物。直接化学发光剂酶促反应发光剂直接化学发光剂直接化学发光剂直接化学发光剂 直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作

14、用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。吖啶酯在碱性条件下与H2O2 就可产生化学发光现象。在碱性介质中氧化时，这些化合物经历共价键的断裂，经过一个二氧酮的中间体，产生电激发的N-甲基吖啶酮，当它恢复到基态时，在430nm出释放出光子。 AE特性化学发光反应简单，无需催化剂，背景噪声低。极其稳定，如2-甲基吖啶酯，因其独特的结构使其有效期长达1 年甚至更久。发光过程快速，1秒内光子散射达高峰，整个过程在2秒内完成。电化学发光剂是指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。特点：反应在电极进行； 电子供体为：三丙胺（TPA） 化学发光剂：三联毗啶钌三联

15、毗啶钌三联毗啶钌分子结构图分子结构图NNNNNNRuOONOO电化学发光剂酶促反应发光剂酶促反应发光剂：酶促反应发光剂：是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。鲁米诺及其衍生物鲁米诺及其衍生物 AMPPDAMPPD鲁米诺及其衍生物鲁米诺发光原理鲁米诺及其衍生物鲁米诺增强发光反应原理 AMPPDAMPPD3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷五、量子点量子点 QDs量子点(quantimim dots, QDs)即半导体纳米粒子，是指半径小于或接近于激子玻尔半径的半导体纳米晶粒（1-10nm）。由I

16、I-VI族或III-V族元素组成，性质稳定，可接受激发光产生荧光，具有类似体相晶体的规整原子排布。广义的量子点还包括 IV-VI 族、V-VI 族元素组成的纳米晶，以及金簇、银簇、硅点、碳点、复合型荧光纳米颗粒等。量子点的光学特性荧光强度高，稳定性好，抗漂白能力强荧光强度高，稳定性好，抗漂白能力强所谓光漂白是指由光激发引起发光物质分解而使荧光强度降低的现象。有机荧光色素的光漂白速率很快，而量子点的光漂白作用则小得多。具有具有“调色调色”功能，一元激发多元发射功能，一元激发多元发射不同粒径的量子点具有不同的颜色，可用同一波长的光激发不同大小的量子点，获得多种标记颜色。激发光波长宽，而发射光波长窄

17、激发光波长宽，而发射光波长窄量子点的激发光波长范围很宽，具有较大的Stokes位移和狭窄对称的荧光谱峰。量子点调色功能在紫外光激发下，相同组成不同粒径的量子点的发射光谱量子点的制备大致分为两种方法：物理制备法、化学合成法。物理制备法物理制备法可制得粒径易控的量子点，但所需实验设备昂贵，广泛使用受限。化学合成法化学合成法有水相和有机相合成法有机相体系 可制备性能优良的量子点，如 CdSe及CdSe/ZnS。 量子点分散性好、稳定性高、不易沉积，但水溶性太差。水相体系 操作简单、成本低廉、量子点表面形貌及性质可控、易修饰各种基团。量子点表面修饰无机壳层修饰法和化学修饰法是两种常用的量子点修饰无机壳

18、层修饰法和化学修饰法是两种常用的量子点修饰方法方法。无机壳层修饰法无机壳层修饰法合成核/壳结构的量子点，如在CdSe量子点的外面包覆一层CdS 或ZnS 就构成了以CdSe为核，以CdS 或ZnS 为壳的量子点。化学修饰法化学修饰法用含巯基的有机分子如二氢硫辛酸、巯基乙酸和聚乙二醇等对量子点进行表面修饰。六、胶体金胶体金（胶体金（colloidal goldcolloidal gold）也称金溶胶，是金盐被还原成金原子后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核(原子金Au)及包围在外的双离子层构成(内层为负离子层AuCl2-，外层是带正电荷的H+)。由于静电作用，金颗粒之间相互排斥而悬浮成为

19、一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，故称胶体金。胶体金特性具有胶体的多种特性具有胶体的多种特性特别是对电解质的敏感性，电解质能破坏胶体金颗粒的外周水化层，从而打破胶体金的稳定状态。胶体金颗粒大小不同，呈色不同，光吸收性也不同胶体金颗粒大小不同，呈色不同，光吸收性也不同最小的胶体金(2nm5nm)是橙黄色，中等大小胶体金(10nm20nm)是酒红色，较大颗粒胶体金(30nm80nm)则是紫红色。胶体金制备原理胶体金是氯金酸(HAuCl4)在还原剂的作用下，聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电荷的疏水胶溶液。常用的还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、维生素C、白磷、硼氢化钠等。根据还原剂类型以及还原作用

20、的强弱，可以制备0.8nm150nm不等的胶体金颗粒。胶体金制备方法常用的方法为柠檬酸三钠还原法常用的方法为柠檬酸三钠还原法以制备16nm的胶体金为例，取0.01%的氯金酸水溶液100ml，加热至沸腾，磁力搅动下加入1%的柠檬酸三钠水溶液2ml，淡黄色的氯金酸溶液很快变灰色，继而黑色，随后成酒红色。金溶胶颗粒的直径取决于制备时加入的枸橼酸三钠量，金溶胶颗粒的直径取决于制备时加入的枸橼酸三钠量，保持其他条件不变，制备时加入不同剂量的柠檬酸三钠可获保持其他条件不变，制备时加入不同剂量的柠檬酸三钠可获得不同粒径的胶体金颗粒得不同粒径的胶体金颗粒。第二节第二节 常用交联剂及特性常用交联剂及特性重点提示

21、均一的双功能交联剂非均一的双功能交联剂交联剂方法交联剂生物大分子之间的偶联，本质上是生物大分子中活生物大分子之间的偶联，本质上是生物大分子中活性基团之间的连接性基团之间的连接。其连接类型主要有其连接类型主要有：-NH2与-NH2 、-NH2与-CO2H 、-SH与-SH 、-NH2与-SH 、糖基(-OH)与-NH2 、-C=O与-NH2 等。免疫标记常用交联剂免疫标记常用交联剂分子两端各有一个相同或者不同的活性基团，它们可与其它分子上的氨基、巯基、羟基等基团发生共价结合而产生交联作用。交联剂类型根据其两个反应基团是否相同分为均一的和非均一的交根据其两个反应基团是否相同分为均一的和非均一的交联

22、试剂联试剂。均一的双功能交联剂，其两个反应基团相同。非均一的双功能交联剂，两个反应基团不同，每个基团可能于不同的条件下反应。大分子抗原、抗体的标记是利用双功能交联剂使标记物与被标记物结构中的游离的氨基、羧基、硫氢基、咪唑基、酚基、羟基等基团形成不可逆连接。一、一、均一的双功能交联剂均一的双功能交联剂 常用的均一的双功能交联剂（homobifunctional cross-linking reagent）有戊二醛、碳二亚胺等。有-CHO 、-N=C=O 、-N=C=S 、-SO2CH =CH2 等活泼双键, 可与生物大分子中的-NH2 、-OH 、-SH 等进行交联反应。原理简单，反应温和，适用

23、范围广； 副反应较多, 易发生多聚合和分子内交联，使交联物的生物活性显著下降。碳二亚胺缩合法碳二亚胺能激活蛋白质分子上的羧基，反应生成一个肽键（-CO-NH-），经碳二亚胺缩合反应，蛋白质分子中的游离羧基与标记物分子中的氨基形成较稳定的酰胺键。戊二醛法戊二醛分子中两个醛基可分别与两个相同或不同分子上的伯氨形成Schiff 碱, 将两个生物大分子以五碳链的桥连接起来。过碘酸钠氧化法利用过碘酸盐氧化糖蛋白中糖基的邻二羟基成为醛基，再通过醛基与标记物分子中的伯氨基反应形成schiff碱，后者经NaBH4还原NC键成为稳定的结合物。N-羟基琥珀酰亚胺活化法 蛋白质分子羧基通过N-羟基琥珀亚酰胺活化，再

24、与标记物分子中的氨基偶联形成酰胺键。非均一的双功能交联剂N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)-丙酸醋(SPDP)等属于非均一双功能交联剂(heterobifunctional cross-linking reagent)。SPDP分子两端分别含有对脂肪链上的巯基和伯氨基十分敏感，有专一作用的二硫吡啶基和琥珀酰亚胺酯基，可将含巯基和氨基的两种蛋白质很容易地交联起来；如果两种蛋白质不含巯基，可用SPDP在其中一个蛋白质分子中引入二硫吡啶基，然后再用二巯基苏糖醇（DTT）还原成游离巯基，最后使二者交联起来。SPDP分子结构式SPDP交联原理将蛋白质（P1-NH2）通过酰胺化学反应，引入二硫吡啶基

25、（DTP）。将DTP化的蛋白质通过T-DE反应，与含巯基的蛋白质（P2-SH）进行交联。如果第二种蛋白质分子（P2）不含巯基，可按反应（1）而得到P2-NH-DTP，再与二巯基苏糖醇（DTT）起反应，将DTP基还原成巯基，所得P2NHCOCH2CH2SH，再按反应（2）方式交联，制得结合物II（P1-NHCOCH2CH2SSCH2CH2CONHP2）。SPDP交联法优点对蛋白质的伯胺基和脂肪族链上的游离巯基反应敏感，专一性很强，反应容易控制，可避免副反应。交联的程度容易测定，交联后的大分子生物活性高于一般交联剂方法。可通过还原裂解使其再生。第三节第三节 放射性核素与抗原抗体结合物的放射性核素与

26、抗原抗体结合物的制备制备重点提示标记物与抗原抗体结合物的制备基本方法标记物与抗原抗体结合物的纯化标记物与抗原抗体结合物的鉴定标记物与抗原抗体结合物的保存放射性核素与抗原抗体的结合物制备放射性核素与抗原抗体的结合物制备一、一、基本方法基本方法氯胺T(ch-T)法是常用的标记方法，氯胺T是一种氧化剂，它能使125I+液中带负电荷的碘离子氧化成带正电荷的碘，然后取代抗原酪氨酸残基芳香环上的氢ch-T是对甲苯磺基酰胺的N-氯衍生物钠盐，在水中易分解成具氧化性的次氯酸：次氯酸可将125I氧化成带正电荷的125I+，后者可取代抗原（或抗体）中酪氨酸残基苯环上的氢原子，形成稳定放射标记物；最后加入还原剂偏重

27、亚硫酸钠（Na2S2O5）可终止反应 125I结合物制备直接标记法氯胺T法化学或酶促反应，将放射性负电碘离子氧化成碘原子或正电碘离子，通过取代反应置换被标记物分子中酪氨酸或酪胺残基以及组胺残基上的氢原子。 125I-Ch-T氧化125I或125I+取代反应125I-标记物（混合物）氯胺T(ch-T)法使用无还原剂的高比放射性碘源ch-T用量要低控制总反应体积200l反应时间1分钟2分钟弱碱性反应条件 二、放射性核素标记结合物的纯化标记反应后形成的结合物不能直接使用，需去除游离125I和其他杂质。游离125I和125I标记抗体（抗原）分子大小相差悬殊，采用凝胶层析即可分离，如葡聚糖凝胶（Seph

28、adex G-50）柱层析。125I结合物纯化凝胶过滤法离子交换层析法 聚丙烯酰胺凝胶电泳 高效液相色谱法 去除游离125I去除过度标记的标记物三、放射性核素标记结合物的鉴定放射性核素结合物的鉴定包括放射化学纯度、比放射活性放射性核素结合物的鉴定包括放射化学纯度、比放射活性和免疫活性三个参数和免疫活性三个参数：放射化学纯度指在标记物中结合在抗原（或抗体）上的放射活性占该标记物总放射活性的百分比。比放射活性是指单位质量标记物中所含的放射性强度，也可理解为每分子抗原（或抗体）平均所结合放射性原子数目，常用Ci/g或Ci/mmol表示。免疫活性指标记物与抗原或抗体反应的能力。免疫活性测定方法，用少量

29、标记物与过量抗体反应，测定与抗体结合部分（B）的放射活性，并计算与加入的标记物总放射活性（T）的百分比（B/T）。125I结合物鉴定 标记物质量高纯度高比放射活性完整免疫活性 放射化学纯度单位标记物中结合于抗原或抗体上的放射活性占该标记物总放射性的百分比应大于95% 免疫活性（immunoreactivity）标记物与抗原或抗体结合的能力标记物与过量抗体反应百分比该值越大, 标记物免疫活性好 四、放射性核素标记结合物的保存四、放射性核素标记结合物的保存 放射性核素标记结合物在放射性核素标记结合物在2828避光保存。避光保存。注意放射防护，废弃物须按放射防护条例规定注意放射防护，废弃物须按放射防

30、护条例规定处理。标记物长期贮存后可因脱碘和自身辐射处理。标记物长期贮存后可因脱碘和自身辐射造成蛋白质破坏而形成碎片，同样可以采用上造成蛋白质破坏而形成碎片，同样可以采用上述方法对标记物重新进行纯化。述方法对标记物重新进行纯化。第四节第四节 荧光素与抗原抗体结合物的制备荧光素与抗原抗体结合物的制备一、基本方法荧光素与蛋白质结合的化学反应基团主要有三种类型荧光素与蛋白质结合的化学反应基团主要有三种类型：酰基氯，由磺酸制备。异硫氰酸和重氮盐类，这两种通常由相应的胺制备，通过化学键作用于相应的抗原、抗体反应结合。目前标记方法主要是透析法和搅拌法两种目前标记方法主要是透析法和搅拌法两种：以FITC标记抗

31、体（IgG）为例：FITC含有异硫氰基，在碱性条件下能与IgG的自由氨基结合，形成荧光抗体结合物。FITC标记结合物制备荧光素标记抗体的方法荧光素标记抗体的方法原理:利用抗体蛋白的自由氨基自由氨基与FITC的异硫氰基异硫氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。标记方法:搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。 透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀，非特异染色较低。透析法二、荧光素标记结合物纯化抗体标记完成后，还应对标记抗体进行纯化，以除去未结合的游离荧光素，纯化方法可采用透析法和凝胶过滤法。透

32、析法透析法将标记的抗体放入透析袋中，不断更换透析液透析1周左右，直至透析液在紫外灯照射下不发出荧光为止，本法适用于蛋白含量低的标记物。 凝胶过滤法凝胶过滤法将标记的抗体通过SephadexG25或G50凝胶柱，洗脱第一峰为荧光素标记抗体峰，第二峰为游离荧光素峰，收集第一峰即可。本法简便快捷，可在数小时内完成。三、荧光素标记结合物纯化荧光抗体的纯化荧光抗体的纯化去除游离荧光素及其降解产物：去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤去除荧光素未结合和结合过度的抗体：去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法去除交叉反应或非期望抗体：去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收荧光素

33、标记结合物鉴定荧光抗体的鉴定荧光素与蛋白结合率 F/P=抗体效价：双向免疫扩散试验抗体特异性：吸收试验、抑制试验保存：-20：保存1年2年 真空干燥：长期保存nmnmAAA495280495nm35. 087. 2第五节第五节 酶与抗原抗体的结合物制备酶与抗原抗体的结合物制备一般是通过交联剂将酶与抗体或抗原相结合。交联方法主要有：戊二醛法、酶醛化法、重氮化法、碳二亚胺法、混合酸酐法等。一般都是利用小分子上的活性部位与蛋白质上的氨基、羧基、酚基、巯基或羟基进行化学反应。一、基本方法制备方法过碘酸钠法（直接法）过碘酸钠法（直接法）常用于HRP标记抗体或抗原戊二醛交联法戊二醛交联法戊二醛分子中有两个

34、相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。过量戊二醛+酶 酶-戊二醛-抗体（抗原）洗涤Ab/Ag戊二醛交联法戊二醛为同源双功能交联剂，它有两个相同的醛基，可分别与酶分子和抗体(抗原)分子上的氨基结合。戊二醛法又根据试剂加入的方法分为一步法和二步法。一步法是将抗体(抗原)、酶和戊二醛同时发生反应。此法操作简便，可用于HRP、ALP标记抗体(抗原)。但酶标记物的产率低，酶标记物易聚合，而且酶与酶、抗体与抗体之间也会发生交联，影响标记物的质量。戊二醛交联法二步法则是将相对过量的戊二醛与酶反应，让酶分子上的氨基仅与戊二醛上的

35、醛基结合，不发生酶与酶之间的结合，除去未与酶结合的多余戊二醛后，再加入抗体(抗原)，形成酶-戊二醛-抗体(抗原)结合物。其特点是酶标记物均一，标记效率也较一步法提高。改良过碘酸钠法此法是目前用于HRP标记抗体或抗原的最常用方法。过碘酸钠可将与酶活性无关的多糖羟基氧化为醛基，后者与抗体蛋白中的游离氨基结合形成Schiff碱，再加入硼氢化钠还原后，即生成稳定的酶标记物。为防止酶蛋白分子中氨基与醛基发生自身偶联反应，标记前需用2,4-二硝基氟苯封闭酶蛋白分子中残存的-氨基和-氨基。二、酶标记结合物纯化标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异

36、显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度。常用的纯化方法：葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯三、酶标记结合物鉴定每批制备的酶标记物都要进行质量和标记率的鉴定，每批制备的酶标记物都要进行质量和标记率的鉴定，质量鉴定包括酶活性和抗体（抗原）的免疫活性的鉴定质量鉴定包括酶活性和抗体（抗原）的免疫活性的鉴定。常用的鉴定方法常用的鉴定方法： 免疫电泳或双相扩散法常用免疫电泳或双向扩散法，出现沉淀线表示酶标记物中的抗体（抗原）具有免疫活性。沉淀线经生理盐水反复漂洗后，滴加的底物溶液，若能在沉淀线上显色，则表示酶标记物中的酶仍具有活性。也可直接用ELSIA方法

37、测定酶标记率测定常用分光光度计法分别测定酶标记物中酶和抗体（抗原）蛋白的含量，再用公式计算其标记率。四、酶标记结合物的保存 酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保存不当，极易失活。高浓度的结合物较为稳定，冷存不当，极易失活。高浓度的结合物较为稳定，冷冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但冻干过冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但冻干过程中引起活力的减低，而且使用时需经复融。结合程中引起活力的减低，而且使用时需经复融。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。箱的冰格中较长时间保

38、存。第六节第六节 化学发光剂与抗原抗体的化学发光剂与抗原抗体的结合物制备结合物制备一、基本方法化学发光剂化学发光剂标记反应分为直接偶联和间接偶联两种方标记反应分为直接偶联和间接偶联两种方式式：直接偶联是通过偶联反应，使标记物分子中的发光集团直接连接到被标记物分子的反应基团上。间接偶联是通过交联剂在标记物和被标记物之间插入一条链或一个基团，通过“桥”可以在原有结构中引进新的活性基团，增加反应活性，减弱偶联双方分子结构中存在的空间阻碍效应。二、化学发光剂标记结合物的纯化多数经偶联反应制备的结合物，使用前需采用透析法、凝胶过滤法或盐析沉淀法等进行纯化，目的是除去反应系统中存在的未结合的发光剂和交联剂

39、。三、化学发光剂标记结合物的鉴定由于标记过程的不规范或存放过程中可能出现的脱落现象，对新制备已纯化或经长时间保存的结合物，在使用前均需测定蛋白质的含量、免疫学活性和发光效率等三项指标，以保证实验结果准确、可靠。四、化学发光剂标记结合物的保存 结合物一般可分装保存在-704条件下，最好冷冻干燥保存，这样可保存数年之久不丧失活性。第七节 稀土离子与抗原抗体的结合物制备一、基本方法镧系元素离子不能直接与抗原或抗体分子结合，需利用具有双功能基团的螯合剂。常用的双功能螯合剂有1-（对-苯偶氮）-EDTA、异硫氰酸苯基-EDTA、异硫氰酸苯甲基-EDTA和二乙烯三胺五乙酸（DTPA）等。螯合剂可先螯合EU3+，再连接蛋白质（一步法），或先连接蛋白质，再螯合EU3+(二步法)。针对小分子半抗原，则需先将半抗原与大分子载体蛋白（牛血清白蛋白、多聚赖氨酸等）连接，再标记