毕业论文,初稿1

1、 本科毕业论文（设计）题目：黄粉虫热休克蛋白70基因片段的克隆与序列分析 学生：纪成兴 学号：201040830212 学院：生命科学学院 专业：生物科学 入学时间：2010年9月 16日 指导老师：崔亚东 职称：教授 完成日期：2014年5月1日 诚信承诺书本人在此承诺，此次论文黄粉虫热休克蛋白70基因片段的克隆与序列分析是在崔亚东教授的指导下独立完成，没有抄袭行为。在此篇论文中出现的其他作者的观点和材料的处理都作出了注释。如若不是，一切后果由本人自行承担。 承诺人签名： 时间：2014年 5月1日黄粉虫热休克蛋白70片段基因的克隆与序列分析摘要：本实验是以黄粉虫(Tenebrio moli

2、tor)为实验材料，用Tris苯酚提取黄粉虫DNA。根据GenBank 中发表的昆虫热休克蛋白70( heat shock protein 70, HSP70) 基因的保守序列设计引物, 利用PCR 扩增的方法, 获得黄粉虫(Tenebrio molitor )的基因序列， 测序结果表明, 序列长为915bp，含有270aa。HSP氨基酸序列的系统进化分析表明：黄粉虫的热休克蛋白HSP70氨基酸序列与其他昆虫之间存在高度的同源性，更与小菜蛾(Plutella xylostella)的热休克蛋白HSP氨基酸序列的同源性高达97%。关键词：黄粉虫、保守序列、热休克蛋白70、提取DNA、PCR、基因

3、序列Cloning and sequence analysis of Tenebrio molitor heat shock protein 70 gene fragmentAbstract： This study is the yellow mealworm (Tenebrio molitor) as experimental material, DNA extracted with Tris phenol Tenebrio.According to published GenBank insect heat shock protein 70 (heat shock pr

4、otein 70, HSP70) gene sequences conserved primers were designed to amplify by PCR method to obtain yellow mealworm (Tenebrio molitor) gene sequence, sequencing results showed that the sequence length 915bp, containing 270aa. System HSP amino acid sequence phylogenetic analysis showed that: between t

5、he heat shock protein HSP70 larva and other insects highly amino acid sequence homology, more homology with the diamondback moth (Plutella xylostella) HSP heat shock protein amino acid sequences of up to 97%.Key words： Tenebrio molitor conservatism sequence HSP70 DNA extraction PCR gene order目录一 综述二

6、 实验材料及其实验步骤2.1实验材料 2.1.1实验材料. 2.1.2实验试剂. 2.1.3实验仪器.2.2实验步骤 2.2.1设计引物. 2.2.2DNA提取. 2.2.3目的基因PCR三 结果与分析 3.1得到克隆到的基因序列 3.2分析所克隆到的基因序列是否就是热休克蛋白70的基因序列.四 参考文献五 致谢一 综述： 热休克蛋白（HSP）是生物体或细胞组织在不良条件下产生的一种特殊的蛋白质，它能使生物体或细胞更好的适应不良环境，使其减少其受到的伤害，我们将这种反应叫做热休克反应，这种特殊的蛋白质就叫做热休克蛋白（HSP）。目前比较常见的是Morimoto1将热休克蛋白分为4种：HSP90

7、、HSP70、HSP60以及小HSP，另外还有分子量较大的HSP1001000KD。而HSP70在不同的生物体内的含量是不同的并且在发生过应激反应后其含量会明显的升高2，因此HSP70是人们最关心的也是目前对热休克蛋白家族研究最深的热休克蛋白。 各种生物的热休克蛋白70基因都有高度的保守性，无论是细菌还是真菌，原核生物还是真核生物中，我们总能发现其之间存在高度的同源性，HSP70是热休克蛋白家族中含量最多的一种蛋白，我们将其结构分为结构型和诱导型，结构型是存在于非应激的正常细胞中，细胞发生应激反应以后含量会略微增加，而诱导型则是出现在应激细胞中这些结构存在于细胞中的不同区域3。当发生应激反应时

8、，大部分的HSP70存在于细胞核中，而当反应结束后则又回到细胞浆中，若再次发生应激反应，则又回到细胞核中，如此反复。 关于热休克蛋白的作用，目前主要的作用有4种：1HSP70与细胞的耐热性 2分子伴侣作用 3HSP70与细胞生理状态 4HSP70与免疫应答。 1 HSP70与细胞的耐热性：如果将哺乳动物长时间放在41度的高温下，细胞会失活，最终死亡。如果将哺乳动物间隔放在41度高温和常温下，在哺乳动物体内的细胞会产生耐热性。对此现象，之前的科学家做了相关实验，得出的结论有两个方面：一方面许多经过热处理的细胞，其细胞体内的HSP70表达量会增加4，但是如果过量的表达则会损伤细胞5；另一方面：通过

9、竞争性抑制或注射其抗体，会发现其热敏感性提高6。2 分子伴侣作用：分子伴侣是指导其他蛋白质进行正确装配，但是本身不是最终产物的组成成分的一种特殊的蛋白质。而HSP70则是与未折叠或错误折叠的蛋白质结合，使其蛋白质聚合物解离，重新进行正确折叠的一种蛋白质。因此我们说HSP是一种分子伴侣。3 HSP70与细胞生理状态：Nitta对两组缺血细胞进行检测，检测不同时间内细胞内的HSP70的含量及其种类的差异7。结果发现两个月鼠心肌细胞中的诱导型HSP70表达明显增强，而在18个月的鼠心肌细胞中则表达量不是很明显。2个月的鼠心肌细胞中会发现少量的结构型HSP70，但是18个月的心肌细胞中则没有。随着有机

10、体的衰老和细胞的老化，细胞内的HSP70RNA的含量，HSP70与底物的结合水平，HSP70的合成能力都会下降。而且衰老的有机体或老化的细胞对外环境做出的反应比较迟钝，致使HSP70的合成减少。根据其分子伴侣作用，可知HSP70不仅可能是促进细胞是否老化的因素而且还可以根据HSP70的含量来判断细胞的老化程度。4 HSP70与免疫应答：研究表明作为HSP家族的重要成员的HSP70在免疫方面有着许多的功效。在基础免疫方面，除了发现热休克细胞中含有可耐受肿瘤坏死和自然杀死或杀伤细胞。另外有相关实验Vanbukirk 8表明HSP可能参与抗原的加工，提呈。 二 材料及其处理步骤2.1材料、试剂和仪器

11、 2.1.1实验材料：黄粉虫（从花鸟市场买来的生长良好的黄粉虫2两，其中包括维持其生长的食物麦麸，经培养数天以后备用） 2.1.2实验试剂： PBS试剂：取磷酸二氢钾1g，磷酸二氢纳1g，溶于100ml蒸馏水中，调至ph为6.8。 碧云天生产的哺乳动物基因组DNA抽提试剂盒(样品裂解液、蛋白酶K、10M醋酸铵、Unclease Free Water），Tris平衡苯酚、氯仿和无水乙醇(自备)。 PCR试剂：HSP70引物、DNA模板 制胶和跑胶试剂：琼脂糖、1倍TBE、EB、DNALoadingBuffer、2000bpDNAmarker PCR试剂盒（Taq PCR Master Mix、S

12、terlized  ddH2O、MgCl2）2.1.3 实验仪器： DNA提取仪器：研钵、10ul-100ul移液枪、100ul-1000ul移液枪、枪头、Vortex器、离心机、离心管、50的恒温水浴锅、冰箱。 PCR和制、胶跑胶仪器：PCR管、0.5ul-5ul移液枪、5ul-50ul移液枪、枪头、PCR仪器、电子天平、锥形瓶、量筒、微波炉、制胶板、电泳仪。2.2实验步骤 （实验过程均是戴手套操作）： 2.2.1 HSP70引物设计：根据Genbank上发表的油松毛虫(Dendrolimus tablulaeformis)和黑脉金斑碟(Danaus plexippus)

13、热休克蛋白70基因序列设计的引物，利用编码热休克蛋白HSP70的基因之间的高度保守性，设计出如下引物： HSP701：AGCCTACAAAGGTGAAGATAA HSP702：TGTCAAGACCGTAAGCAAT2.2.2 DNA的提取： 将黄粉虫（5龄幼虫）至于PBS中清洗 将清洗过的黄粉虫(约20豪克)放于研钵中加入5ul蛋白酶K，进行研磨致匀浆 将匀浆吸入离心管中，加入500ul的样品裂解液，并Vortex混匀过后放入50的恒温水浴锅中裂解4个小时 将解离后的离心管放入离心机中在12000转的速度下离心1min，取其上清液 加入500ulTris平衡苯酚进行提取抽样，吸出酚相及中间相，

14、剩余的水相用等体积的Tri平衡苯酚在抽提一次，同样抽取酚相及中间相。剩余的水相用等体积的氯仿再提取一次 吸出约300ul的上清液，加入60ul10M醋酸铵和600ul无水乙醇，颠倒数次混匀。 11000转的速度下离心1min，弃上清。加入70%乙醇洗涤DNA沉淀2次 尽量吸除残余的乙醇，待看不到明显的液体时，立即加入70ul的Unclease Free Water溶解DNA。 将所得到的DNA溶液放入4冰箱中以后备用。2.2.3 DNA的检测: 制胶：称取0.3g（或0.5g）琼脂糖和量取30ml（或50ml）1倍TBE放入锥形瓶中，适当摇晃，放入微波炉中加热使其琼脂糖充分溶解，等其冷却至65

15、时加人EB溶液，充分摇匀后倒入制胶板中，放在室温下冷却30min后，拿去梳子。 跑胶：拿一个干净的一次性手套平放在桌面，在手套上滴上若干滴DNA loading Buffer，去约等量的DNA溶液与loading buffer混匀以后滴入点样孔（点完样后要点DNA Marker做对比），放入电泳槽进行跑胶。 图一 提取到的黄粉虫DNA 2.2.4 目的基因扩增（PCR）:选用的PCR试剂盒如下： Taq PCR Master Mix ComponentsBS92951ml BS9296 5x1mlTaq PCR Master Mix1ml5x1mlSterlized ddH2O1ml5x1ml

16、MgCl2（25Mm）0.5ml1ml 取灭过菌的PCR管3只，分别编号为1、2、3。相PCR管中依次加入Taq PCR Master Mix25u、DNAtemplate1ul、引物1和2各2ul、Unclease-free ddH2O 20ul 将3只PCR管放入PCR机中进行PCR,PCR的过程如下图所示：Pre-Duration94 4mian 1cye Duration 94 30sec30cye Anneal 50 30sec Extend 72 1km/min Post-Exteng 72 10min 1cye Hold 4 N.A. N.A. 2.2.5 目的基因检测1 制胶：

17、同DNA的检测中制胶一样。 2 跑胶：取一干净的一次性橡胶手套平铺在操作台上，滴上若干滴DNA loading Buffer，分别在每滴DNA loading Buffer上滴上一滴经过PCR扩增的目的基因溶液。充分混匀后，进行点样。 图二 提取到的目的基因（1,2,3点样孔中滴加的是经过PCR后的产物，4点样孔中滴加的是2000bpDNA Marker） 2.2.6 将扩增到的基因片段邮寄到上海生工公司进行测序，得到目的基因以后，利用NCBI的ORF对序列进行分析，得到的氨基酸序列与其他昆虫编码HSP70基因的氨基酸序列进行同源性比较。三 实验结果与分析 3.1 实验结果：所得到的目的基因片

18、段大小为915bp，其基因序列为：GCCTACCTCGGTAAAACTGTGCAGAATGCAGTAATTACGGTTCCAGCATACTTCAACGACTCTCAAAGACAGGCCACAAAAGATTCAGGTACAATCTCTGGTCTGAACGTTCTCCGAATCATCAACGAACCTACTGCTGCTGCGATTGCTTACGGTCTTGACAAGAAGGGAGGTGGAGAACGTAACGTCCTTATTTTCGATCTTGATGGTGGCACTTTTGATGTGTCCATCTTGACCATTGAGGATGGTATCTTTGAGGTGAAATCTACTGCTGGTGACACAC

19、ATTTGGGTGGAGAGGACTTTGACAACCGTATGGTCGACCACTTCGTTCAGGAGTTCAAGAGGAAGTACAAGAAGGATCTCACCACCAATAAGAGGGCTCTGCGACGTCTCCGAACAGCGTGTGAGAGAGCGAAGCGAACCCTGTCTTCATCCACCCAGGCCAGCATTGAAATTGAATCCTTATATGAAGGTATCGACTTCTACACGTCTATCACCAGGGCGCGTTTCGAAGAACTGAATGCTGACCTCTACAGATCAACGATGGAGCCAGTGGAGAAGTCTCTCCGTGATGCCAAGATGG

20、ACAAGGCTCAAATCCACGACATCGTCCTCGTCGGCGGATCCACCCGTATTCCTAAAGTGCAAAAGCGGTTGCAAGACATCTTCAATGGCAAGGAGCTGAACAAATCCATCAACCCCGACGAGGCCGTCGCGTACGGCGCCGCCGTCCAGGCTGCCATTCTCCACGGCGACAAGTCTGAGGAAGTACAGGACCTGGTGTTGCTTGACGTCACTCCCCTGTCGCTCGGTATCGAGACCGCTGGTGGAGTGATAACCACCCTCATCAAGCGCAACACCACCATCCCCACCAAGCAGACCCAGA

21、CCTTCACTACCTACTCTGACGATCAACCCGGTGT利用NCBI的ORF对序列进行分析得到270AA为：103 ctgaacgttctccgaatcatcaacgaacctactgctgctgcgatt L N V L R I I N E P T A A A I 148 gcttacggtcttgacaagaagggaggtggagaacgtaacgtcctt A Y G L D K K G G G E R N V L 193 attttcgatcttgatggtggcacttttgatgtgtccatcttgacc I F D L D G G T F D V S I L T

22、238 attgaggatggtatctttgaggtgaaatctactgctggtgacaca I E D G I F E V K S T A G D T 283 catttgggtggagaggactttgacaaccgtatggtcgaccacttc H L G G E D F D N R M V D H F 328 gttcaggagttcaagaggaagtacaagaaggatctcaccaccaat V Q E F K R K Y K K D L T T N 373 aagagggctctgcgacgtctccgaacagcgtgtgagagagcgaag K R A L R

23、R L R T A C E R A K 418 cgaaccctgtcttcatccacccaggccagcattgaaattgaatcc R T L S S S T Q A S I E I E S 463 ttatatgaaggtatcgacttctacacgtctatcaccagggcgcgt L Y E G I D F Y T S I T R A R 508 ttcgaagaactgaatgctgacctctacagatcaacgatggagcca F E E L N A D L Y R S T M E P 553 gtggagaagtctctccgtgatgccaagatggacaag

24、gctcaaatc V E K S L R D A K M D K A Q I 598 cacgacatcgtcctcgtcggcggatccacccgtattcctaaagtg H D I V L V G G S T R I P K V 643 caaaagcggttgcaagacatcttcaatggcaaggagctgaacaaa Q K R L Q D I F N G K E L N K 688 tccatcaaccccgacgaggccgtcgcgtacggcgccgccgtccag S I N P D E A V A Y G A A V Q 733 gctgccattctccacg

25、gcgacaagtctgaggaagtacaggacctg A A I L H G D K S E E V Q D L 778 gtgttgcttgacgtcactcccctgtcgctcggtatcgagaccgct V L L D V T P L S L G I E T A 823 ggtggagtgataaccaccctcatcaagcgcaacaccaccatcccc G G V I T T L I K R N T T I P 868 accaagcagacccagaccttcactacctactctgacgatcaaccc T K Q T Q T F T T Y S D D Q P

26、913 ggt 915 G经过NCBI中BLAST的ptotien blast可以测得与其他昆虫编码HSP70的基因之间的同源性，如下图： 图三 得到的目的基因与其他昆虫编码HSP70的同源性比较 黄粉虫热休克蛋白HSP70与油松毛虫(Dendrolimus tablulaeformis)的同源性为95% 、与小菜蛾(Plutella xylostella)的同源性为97%、与黑脉金斑碟(Danaus plexippus)的同源性为96%、与大豆蚜(Aphis glycines)的同源性为94%、与入侵红火蚁(Solenopsis invicta)的同源性为93%、与摇蚊(Chironomus

27、 tentans)的同源性为92%、与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)的同源性为91% 和与苜蓿切叶锋(Megachile rotundata)的同源性为90%。并在此基础上建立系统净化树，如下图： 图四 HSP70家族在不同物种的系统进化树 注：油松毛虫(Dendrolimus tablulaeformis)小菜蛾(Plutella xylostella) 黑脉金斑碟(Danaus plexippus) 大豆蚜(Aphis glycines) 入侵红火蚁(Solenopsis invicta) 摇蚊(Chironomus tentans) 虹鳟(Oncorhynchus myk

28、iss苜蓿切叶锋(Megachile rotundata) 3.2 讨论与分析：PCR结果分析：通过设计的引物对黄粉虫的DNA进行PCR扩增，得到的PCR产物通过1%的磷胶进行磷胶电泳得到了一条单一的、明亮的、清晰的条带。 黄粉虫热休克蛋白HSP70基因的序列分析：进过PCR扩增的目的基因产物经过上海生工公司测序以后，得到了编码黄粉虫热休克蛋白HSP70的基因序列长度915b。得到的核苷酸序列经过经过NCBI的ORF对其进行分析，得到了270个AA（试验结果中有）。得到的氨基酸序列与其他昆虫的HSP70序列都要高度的同源性，见图三。同源性分析和进化树构建：采用NCBI中的protien bla

29、st对黄粉虫和其他8种昆虫体内HSP70基因编码的氨基酸序列进行系统进化树分析，见图四。从hsp70氨基酸序列的系统进化树来看，不难看出，各个物种的HSP70聚成一个大分支。黄粉虫的HSP70基因与其他昆虫的HSP70基因之间都存在高度的同源性。结果表明黄粉虫与来源于鞘翅目的小菜蛾的同源性最高高达97%，而与鳞翅目的黑脉金斑蝶和油松毛虫的同源性次之，分别为96%和95%。同属膜翅目的入侵红火蚁和苜蓿切叶锋之间的亲缘关系又是最近的，而离鞘翅目的小菜蛾较远。由此可见保守性较强的HSP70可以作为系统进化的标志。四 参考文献1 Mo rimo to R I, T issieres A , Ceo r

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