课题申报书日本血吸虫（中国大陆株）尾蚴的性别鉴定应用技术研究

1、登记序号 项目编号 科研设计书项目名称： 日本血吸虫尾蚴性别鉴定应用技术的研究承担单位： 单位地址： 邮政编码： 开 户 行： 帐 号： 1103021109000077488项目负责人： 电 话： 职务职称： 填报日期 2004年7月28日江苏省地方病协会二四年制一、 立项依据：血吸虫是一具有两性染色体的吸虫，有8对染色体，其中雌性性染色体为异配子体（zw），雄性为同配子体（zz）。尽管雌性和雄性成虫阶段具有明显的性别二态性，可用肉眼区别，但在幼虫阶段即毛蚴、胞蚴和尾蚴阶段，无明显的性别二态性，肉眼难以区别。传统动物感染方法，是在实验室内取感染了血吸虫的鼠或其它啮齿类动物的肝、肠或粪便收集虫

2、卵，孵化毛蚴，用单只毛蚴感染单只钉螺，养殖筛选阳性钉螺，获得单性尾蚴，用以感染啮齿动物，待其发育至成虫阶段，解剖动物收集成虫，用肉眼或在解剖显微镜下根据形态学的差异，确定感染尾蚴性别。然而，单性雌性尾蚴不能发育到完全成熟的成虫，给鉴别带来一定困难。同时常规方法需要花费时间长，日本血吸虫从尾蚴感染动物到发育成熟至少需3周。采用分子生物学的方法，可快速鉴定尾蚴的性别。代表性差异分析（rda）方法是基于递减杂交法，用于发现两dna基因组群间差异，是一种改良的扣除杂交法，并可用于分离基因组间差异性片段。由于血吸虫为两性染色体的吸虫，其雄性为同性配子体（zz），而雌性为异性配子体（zw）。rda方法从宏

3、观上看，系用雄虫染色体zz去扣除雌虫染色体中的z，从而获得w染色体。drew a.c.等（1995）采用此方法分离出两段曼氏血吸虫雌性特异性序列，并将其制备成探针，用southern blot 方法证实只与曼氏血吸虫雌性基因组dna特异性杂交。w1重复序列作为雌性特异性序列，存在于曼氏血吸虫波多黎各株生活史的各个阶段。并根据曼氏血吸虫雌性该特异性序列w1设计出一对引物w1a和w1b。直接加入该引物对单个尾蚴作pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳。结果雌性尾蚴呈现扩增产物pcr-w1条带，雄性尾蚴不呈现扩增条带。此方法能快速、可靠地用来鉴定曼氏血吸虫尾蚴的性别。基于曼氏血吸虫尾蚴性别鉴定的现有方法，为探索

4、适合日本血吸虫尾蚴性别鉴定方法提供了理论和方法依据。利用代表性差异分析（rda）方法，分离出日本血吸虫雌性特异性序列，将此特异性序列制备成dna探针，用southern blot 方法鉴定日本血吸虫尾蚴性别。也可对此特异性序列进行测序，设计一对引物，对单个尾蚴的dna作pcr扩增，琼脂糖凝胶电泳，则雌性尾蚴呈现扩增条带，雄性则不呈现扩增条带，从而用pcr方法可快速鉴定日本血吸虫单个尾蚴的性别。研究日本血吸虫尾蚴的性别鉴定技术，建立日本血吸虫尾蚴快速鉴定应用技术有助于血吸虫幼虫阶段生物学和生理学实验的研究；对血吸虫病疫苗评价方法的标准化、遗传学的研究；及其流行病学、感染诊断和病理学研究结果的正确

5、评价；不同性别尾蚴的易感性和感染比率以及减虫率（减雌率）和减卵率的正确评估等均具有重要的意义。同时为进一步开发适合我国国情的日本血吸虫尾蚴性别鉴定试剂盒打下基础。二、 主要研究内容、关键技术、目标：1、 研究内容1.1 用代表性差异分析方法获得日本血吸虫雌性基因组dna特异性序列。1.2 对特异性序列测序，设计引物，pcr扩增。1.3 实验室内建立一种简单、快速的日本血吸虫尾蚴性别鉴定方法。2、 关键技术2.1 日本血吸虫雄虫、雌虫基因组dna的提取2.2 代表性差异分析方法（rda）和pcr。2.3 低熔点凝胶回收雌性特异性片段2.4 大肠杆菌e.coli tg1感受态细胞的制备技术、dna

6、的重组和克隆筛选、重组dna的转化及质粒dna的提取。2.5 dna探针的制备和southern blot 验证方法2.6 雌性特异性序列测序和引物设计。3、 目标建立一种简单、快速、灵敏的日本血吸虫尾蚴性别鉴定方法。三、 研究方法及技术路线1. 用传统方法确定尾蚴的性别，获取单性尾蚴样本1.1 以逸蚴法筛选出阴性钉螺用于感染，所有用于实验的螺均筛选3次。1.2 以单只毛蚴感染单只钉螺；螺感染后在光照培养箱中养殖90天或在春夏季室温条件下养殖100天。逸蚴法筛选出阳性钉螺，取单性尾蚴感染小鼠，35天后剖杀，取成虫确定尾蚴的性别。并分别收集单性尾蚴分别编号保存于-70液氮备用。2. 用代表性差异

7、分析方法分离日本血吸虫雌性特异性序列2.1 感染家兔4只，每只约用1500-1800条尾蚴。45天后剖杀家兔，收集成虫，在解剖镜下将成虫雌雄分开，分别保存于-70液氮中备用。2.2 取雌虫、雄虫各200条用基因组dna提取试剂盒分别提取雌虫和雄虫的基因组dna。2.3 用限制性内切酶hind对雌虫、雄虫dna进行酶切。将酶切产物与两条适配子（r hind24,5-agcactctccagcctctcaccgca-3和r hind12,5-agcttgcggtga-3）组成的接头用t4连接酶进行连接。2.4 以连接物为摸板，做pcr扩增；并琼脂糖凝胶电泳看连接情况。2.5 扩增子的纯化 对雌虫、

8、雄虫dna的pcr产物用pcr纯化试剂盒纯化，限制性内切酶hind酶切。将酶切后的pcr产物过交联葡聚糖g-50柱去除适配子接头r hind24和r hind12。如此制备的雌虫dna为检测子，雄虫dna为驱动子。2.6 扣除杂交法及pcr2.6.1 取以上的检测子1ug连接新的适配子接头（j hind24 5-accgacgtcgactatccatgaaca-3和j hind12 5-agcttgttcatg-3）；然后取0.5ug带有新接头的检测子与40ug的驱动子溶于4ul的3×ee缓冲液中，加入1ul的5m的nacl，扣除杂交，67、20小时；并做pcr和琼脂糖凝胶电泳。2.

9、6.2 将rda的第一轮pcr产物酶切后，过交联葡聚糖g-50柱去除适配子接头j hind24和j hind12，连接下一个新的适配子接头（n hind24 5-aggcagctgtggtatcgagggaga-3和n hind12 5-agcttctccctc-3），取检测子0.1ug与40ug驱动子进行第二轮rda，pcr和琼脂糖凝胶电泳。2.6.3 同上，酶切后过交联葡聚糖g-50柱去除适配子接头n hind24和n hind12，再连接适配子接头j hind24和j hind12，取400pg检测子与40ug驱动子进行第三轮扣除杂交，pcr和琼脂糖凝胶电泳。2.7 将获得的特异性dna

10、片段进行低熔点琼脂糖凝胶回收，pcr纯化试剂盒纯化。2.8.1 制备大肠杆菌e.coli tg1感受态细胞：本实验以e.coli tg1菌株为受体细胞，用氯化钙处理是受体菌处于感受状态。2.8.2 dna的重组和克隆筛选：将获得特异性dna片段连接到载体质粒puc19制得重组质粒；经-互补现象筛选（蓝白斑筛选）方法对重组质粒进行筛选。2.8.3 重组dna的转化：用电击转化的方法，设定电击仪参数（电脉冲25uf、电压2.5kv、电阻200）；吸取一定量的感受态细胞和重组质粒puc19，加入预冷的电击杯，放入样品池，按以上设定参数启动对细胞的电脉冲，仪器会显示4-5ms具有12.5kv/cm的电

11、场强度，脉冲结束后，将细胞取出加入到1mlsoc培养液中复苏1h，接种于特制平板上，37培养。2.8.4 挑选培养出的单个白色菌落，接种于液体培养；用质粒dna提取试剂盒提取质粒dna。2.9 southern-blot 方法验证：利用dig dna labeling anddetection kit制备dna探针和southern-blot验证。3. 将经southern-blot方法验证出的雌虫特异性序列进行测序，并设计引物。4. 根据设计好的引物，对提取的成虫基因组dna和已知性别的尾蚴dna作pcr，琼脂糖凝胶电泳来进行证实。5. 根据设计好的引物，采用直接法（不提取dna）对单个尾蚴

12、作pcr，琼脂糖凝胶电泳，来确定此尾蚴的性别。6日本血吸虫尾蚴性别鉴定pcr法操作条件优化研究。四、 现有工作条件和基础：1 工作基础本实验室是江苏省寄生虫分子生物学重点实验室，寄生虫学为江苏省135重点学科，拥有清洁级小鼠动物房，从事寄生虫免疫学和分子生物学研究二十余年，在仪器设备上完全具备进行寄生虫免疫学和分子生物学研究以及动物试验的的条件。有一定的专业技术和专业人员队伍，人员配置合理。2 仪器设备主要包括温控设备：4、-20、-70冰箱、thz-95型恒温振荡器、scs-24型摇床、光照培养箱、恒温水浴箱、微波炉等；净水设备：milliq水纯化设备；消毒设备：高压蒸气灭菌锅；计量设备：各

13、种精密度天平、量筒、移液管及各种规格的可调试微量移液器、ph计、紫外分光光度计等；离心设备：各种不同规格的普通、高速冷冻离心机；蛋白核酸分析设备：dy-a琼脂糖凝胶电泳仪、多功能蛋白电泳仪（bio-rad）、核苷酸序列分析仪（bio-rad）、核酸蛋白测定仪(beckman)、快速蛋白液相层析系（pharmacia）等；其它分子生物学仪器：pcr仪、超声仪、电穿孔转基因仪、干胶仪、酶标仪、凝胶扫描仪、影像密度扫描仪等。五、 计划进度：总期限一年：1-3月 采购钉螺，并筛选阴性钉螺。2-4月 购阳性钉螺并感染家兔，剖杀家兔收集成虫和虫卵。4-5月 单只毛蚴感染单只钉螺.4-5月 订购试剂5-11

14、月 分离雌虫特异性序列，并测序和设计引物，进行尾蚴性别鉴定。11-12月 收集、分析资料和书写总结报告六、 项目研究预期成果及效益 采用分子生物学技术，建立一种快速、准确、有效的日本血吸虫尾蚴性别鉴定方法，并为进一步开发响应的鉴定试剂盒打下基础；和发表相应的论文。七、 经费预算试剂 万元试验动物 万元试验耗材费 万元交通、差旅费用 万元管理费 万元总计 万元八、 主要研究人员单位 姓名 性别 年龄 专业 职务（称）项目中的作用九、单位意见、盖章 年 月 日 十、主管部门意见、盖章 年 月 日登记序号： 项目编号：中医药、中西医结合科研项目课题设计书课题名称：痛痹颗粒对骨关节炎细胞凋亡和增殖的机

15、理研究申报单位： 江苏省中医院课题负责人： 朱萱萱计划年限：邮政编码： 210029 联系电话： 8661714130306申报日期：江苏省中医药局制填写提纲一、立项依据：与选题直接相关的国内外现状、水平和发展趋势；选题的理论和实践依据；研究目的、意义；本研究达到的科学技术水平，预期社会经济效益和应用推广前景。二、科研假说或技术构思，主要研究内容、关键技术、目标（达到的主要技术指标或技术经济指标），技术特征及创新之处，开发项目应说明开发规模。三、研究试验方法及技术路线（工艺路线）。四、现有工作条件和基础：开展本项研究的技术优势，现有的主要仪器设备及应用合格实验动物的基本条件等；已有工作基础，预

16、试验情况。五、计划进度：根据总的研究期限、年度计划进度，分别列出具体的目标和进度的考核指标。六、参加（协作）单位意见及具体分工（附协议书）。七、经费概算（包括其他部门的拨款、贷款、自筹记忆取得的自主）和核算依据，以及分年度使用计划。填写说明一、内容填写自备附页，用纸大小和封页一致，字迹清楚，装订整齐后按申报要求上报。二、填写提纲所列内容，要全面详细、如实填写。三、封面上“登记序号”“项目编号”请勿填写。1、 立项依据1.1 研究目的、意义骨关节炎（osteoarthritis，oa）又称退行性关节病，以关节软骨发生弥漫性龟裂、纤维化和脱失及因骨组织增生性变化为特征的一组临床征候群，是多见于中年

17、以后的慢性进行性关节疾患。该病发病率随年龄增长而升高，据调查，在美国目前2亿多人口中，就有骨关节炎4500万，发病率占总人口的20%，在老年人中所占比例更高，50岁以上人群中，oa的患病率仅次于心血管疾病，位居第二位。在我国，根据流行病学调查显示，5564岁的人群中发病率达40%，而65岁以上人群的患病率达60%90%。随着计划生育政策的长久实施及经济发展，我国已进入老龄化社会，oa的发病率还将越来越高，这不仅严重危害人民的生活、健康，对社会也将造成很大负担。同时世界其他国家也面临着同样的问题，因而oa引起了国际、国内医学界的相当重视。近年来对oa的研究颇多，在发病机制、检测手段以及治疗方法上

18、均取得较大进步，但总的来说还缺乏令人满意的突破性进展。西药治疗oa的主要手段是非甾体药，但存在副作用大、作用单一及有较多禁忌症等缺点。虽然中药治疗oa也取得了一些经验，但对其具体的作用机制有深入研究的却很少，因此在中医理论的指导下，运用现代科学技术，对疗效确切的中药复方进行深入的机理研究，使中药治疗oa的疗效在国际先进行列中占一席之地，是摆在我们面前非常重要的课题。1.2 国内外现状水平和发展趋势近十年来，国内外对oa进行了较深入地研究，大致归纳如下：1.2.1 流行病学研究已广泛开展在近100种不同类型的关节疾病中，oa是影响人类健康最常见的关节疾患之一，没有明显的种族和地域差异，本病的患病

19、率随年龄增加而增高，故随着人类平均寿命的延长，患病率也有增高的趋势。felson等报道70岁以下人群膝oa患病率为7%（男6.4%，女11.4%），80岁以上为11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射学膝oa70岁以上为27.4%（男30.4%，女25.1%），80岁以上为43.7%。butter等报道，44岁以下、4559岁、60岁以上人群中，放射血oa 患病率各为6.2%、21.6%和42.0%。国内陈顺乐等队13541名钢铁工人的调查结果显示，症状性oa患病率2.2%；无症状性oa患病率53%，其中3039、4049、5059岁患病率各为11%、27%和62%。汕头大学医学院统计5

20、51例，结果40岁以下、4049、5059和60岁以上各占12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同关节oa易感性不同。美国在卫生统计中心调查结果，oa患病率以手最高，以下依次为足、膝、髋。国内陈顺乐等调查结果oa是颈椎最多，以下依次为腰椎、膝、手和腕。本病性别差异在脊柱差别不大，但手、膝、髋oa均以女性较多，且女性骨关节炎的遗传易感性较男性高。在framingham的研究中，felaon等发现女性体重减少11磅，骨关节炎形成的风险相应减少50%。 saase等调查结果，膝oa患病率男、女峰值分别为24.7%和54.6%。根据1994年统计，在美国，骨关节炎的消耗为155亿美元，

21、约为类风湿关节炎的3倍，其中一半以上消耗缘于工作丧失。在我国虽未作全国大范围的普查，但随着老龄化社会进程的不断加快，oa的发病率会越来越高，这必将给家庭、社会带来沉重负担。1.2.2 病因、发病机制有了巨大突破目前基础研究认为软骨的损伤与退变是oa的根本，随着分子生物学免疫学的发展，近年来众多学者对oa关节软骨退行性改变的原因从不同角度进行了大量研究，其发病机制仍未完全明了，又提出了许多学说，如软骨下骨内高压学说：由于骨血液动力学的改变，在骨髓腔容积不变的前提下增加内容物引起压力增高，即表现为骨内压力增高。骨内高压持续增高存在下关节滑液ph值下降，成分改变，干扰并破坏了软骨细胞的正常代谢导致细

22、胞变性坏死，胶原纤维解聚，蛋白多糖分解，软骨下骨破坏、修复，最终产生骨性关节炎。自由基学说：认为自由基对软骨细胞dna和pg的合成具有抑制作用。自由基作用软骨细胞后，引发膜脂质过氧化，使脂质过氧化代谢产物丙二醛增多，丙二醛可与dna发生交联，自由基也可直接攻击软骨细胞dna即合成dna所需的酶，使dna链断裂、碱基损伤从而影响了dna的合成，也造成前列腺（pg）合成障碍。骨关节炎时，滑膜、滑液、血管翳内常有中性白细胞、巨嗜细胞浸润，其表面受免疫复合物、补体等作用能释放大量o2-和h2o2；细胞因子学说：细胞因子对骨关节炎的发生、发展起了重要作用，如白细胞介素-1（il-1）、白细胞介素-6(i

23、l-6)、肿瘤坏死因子（tnf）等在oa中水平明显增高。il-1具有刺激软骨细胞分泌一氧化氮、前列腺e和il-6的作用，引起滑膜炎症和疼痛，同时il-1也是软骨基质降解的主要驱动因子；软骨酶降解学说：oa软骨细胞的基质降解酶类的合成与分泌率明显增加，并与关节炎的严重程度密切相关。参与降解基质大分子的降解酶类可以增加达到几倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白。基质金属蛋白酶，尤其是基质溶素和胶原酶，参与关节软骨的降解过程，这些酶类可以降解细胞外基质的所有成分，与循环系统中的纤维蛋白溶酶和局部合成的纤溶酶原一起，快速降解软骨。在滑膜细胞和软骨细胞产生的il-1和tnf的作用下，软骨细胞以

24、酶原的形式分泌大量的基质金属蛋白酶，而对金属蛋白酶组织抑制剂无影响，使二者失衡从而增加对软骨主要成分型胶原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使软骨进行性破坏；一氧化氮学说：no是一种细胞间信使分子，可介导许多生物学现象。nos可催化重要炎性介质no的产生，oa患者血清、滑液中no含量明显高于正常。no可通过抑制软骨细胞增殖，促进软骨细胞凋亡，改变蛋白多糖和胶原蛋白的合成与分泌功能，同时使软骨细胞分泌透明质酸减少，滑膜粘蛋白解聚，抑制软骨细胞合成软骨基质，促进软骨细胞糖酵解，使软骨破坏。细胞凋亡学说：细胞凋亡是细胞死亡的形式之一，许多正常组织均可发现凋亡，但凋亡亢进与不足则会引起相关疾病，在骨关节炎患者

25、软骨中软骨细胞的凋亡有异常表现，且凋亡细胞数目与骨关节炎严重程度明显相关。凋亡小体存在于软骨细胞小孔或间隙内，其产生的焦磷酸盐能从溶液中沉积钙，有ntpph（nucleosid triphosphate pyrophos phohydrolase）和碱性磷酸酶作用,造成余下软骨细胞修复过程失败，而逐渐发展成关节软骨的完全丢失。oa软骨细胞凋亡主要通过两种相互独立的途径完成，一种是同滑膜炎症无关的途径,由no介导;另一种是同滑膜炎症相关的途径,由fas介导。典型的oa不存在明显的炎症反应,此时软骨细胞凋亡以no途径为主;当产生炎症反应时,则通过as途径加剧软骨细胞凋亡和关节破坏。no通过两种方式

26、造成组织及细胞损伤。一是高浓度的no能抑制多种与线粒体呼吸传递系统及柠檬酸循环有关的酶,从而抑制线粒体呼吸,造成组织损伤;二是no与超氧化阴离子2-反应,生成氧化亚硝基阴离子onoo-,在酸性条件下(如病理条件)迅速分解为oh-和no2自由基,这两种自由基具有很强的细胞毒性,可造成组织细胞损伤。在oa患者中,受损区软骨细胞的凋亡比例明显高于未受损区。fas表达的结果与其相符,oa受损区的fas表达远高于未受损区,提示fas表达可诱导软骨细胞凋亡。除no途径和fas途径外,还有一些因素可导致软骨细胞凋亡、关节破坏,如il-1、il-8、tnf-、pge2、aggrecan g1区等。1.2.3

27、治疗方面有了不少新方法目前中西医治疗oa的药物较多，西药治疗oa主要有三大类，第一类为快作用药，即非甾体药，特点是发挥作用快，但副作用较大，对胃肠、肝肾、血小板均有较大影响，oa多为老年人，长期服用此类药尤其不能耐受，且部分药物价格不菲，而且由于过分的镇痛，导致病人失去警惕过分运动，以致出现“消炎痛髋”，从长期疗效来看反而不佳，最新观点认为乙酰氨基酚应作为治疗oa的首选药，但尚有一定争议，且同样存在上述副作用；第二类为慢作用药，发挥作用慢，疗效不确切，价格昂贵，临床上尚未广泛运用；第三类为软骨保护剂，尚未问世。关节清理术、膝关节置换术，适应症较少，费用高，创伤大，病人难以接受。中哦药治疗oa的

28、研究取得了可喜的进步，但中药治疗仍存在较多共性的问题：多属临床经验，无对照组，特别是西药对照组观察，处方不固定。缺乏用客观的最新的国际公认的、量化的临床观察指标及疗效判断标准为手段来寻找治疗oa的中药。未针对oa发病机制进行临床及动物试验从生化、免疫、病理、细胞分子水平来探讨中药的药物作用机理。缺乏高效的、作用综合、副作用小的新药。中医认为oa属痹症中的痹、痛痹、骨痹，认为其病因与年老体衰、长期劳损、外感风寒湿邪有关，明确指出肝肾亏虚、气血不足、筋骨失养为oa的发病基础，而寒湿、痰瘀为病理因素及病理产物。周尊谦等人在传统中医理论基础上，阐述了膝oa骨内高压血瘀证氧自由基之间的密切关系；谢林等论

29、述了膝oa与血瘀证之间的内在联系，旨在为运用活血化淤药治疗oa提供理论依据。治疗方面从古到今绝大部分医家皆针对其病因病机采用益肝肾、强筋骨、补气血治其本；散寒通络、化痰胜湿治其标。独活寄生汤是用于治疗风寒湿痹、关节疼痛和脑血管后遗症的传统固防，具有补肝肾、活血通络之功，临床常见本方加减治疗oa，疗效比较肯定。朱健儿以本方加味治疗262例，总有效率94.7%。单文龙等用本方加减治疗骨关节炎24例，有效率为87.5%。陆智报道用本方加减治疗104例，总有效率91.3%。1.2.4 实验研究方面有了较大的进展随着对oa发病机理的不断深入认识，对oa的实验研究方面也开始了向多层次多角度的方向发展。动物

30、实验不再只局限于微循环和一般抗炎、镇痛试验，现已使用针对oa的动物实验，并采用相关的指标进行检测。目前实验研究内容主要有以下几个方面，研究最多的是oa的血液流变学、氧自由基及一氧化氮含量等，这些试验一般均可通过建立骨关节炎的模型来完成，也可通过使用其它相似的模型检测相关指标来进行，如可建立急性血淤模型来检查血液流变学指标，使用老龄动物通过检测体内sod及mda含量推断药物的抗氧自由基的能力等。在no对oa影响的实验中，一般采用硝酸还原酶法来测定no含量，运用pt-pcr技术测定nos基因表达。il-1、il-6、tnf等细胞因子、软骨降解酶尤其是基质金属蛋白酶、诱导关节滑膜炎症的物质如纤溶酶原

31、/纤溶酶原激活物和前列腺素pge2、软骨细胞的细胞凋亡及增殖情况、性激素水平等也越来越多地被作为检测指标使用到实验研究中来。1.3 选题的理论和实践依据祖国医学并无骨关节炎的病名，从历代文献来看本病应归属于“骨痹”、“痛痹”范畴。我们认为oa病人除了肝肾亏虚，寒湿痹阻外，一般oa病人体重超重较多，也即为痰湿偏盛之体，另外脾虚生湿及寒湿痹阻日久湿聚成痰，痰淤交阻是引起膝关节肿胀畸形、活动受限的重要因素，所谓顽症怪病皆质之于痰淤。基于现代医学对oa发病机理的深入研究，我们在补益肝肾、活血通络基础上，结合中药对缓解软骨降解，增加软骨细胞功能，抑制滑膜增生及炎症的研究成果，于1995年即对备急千金要方

32、中的独活寄生汤进行化裁，重用活血化淤，加用化痰清热之品，总结制定出了高效、药源广泛、安全可行的痛痹颗粒，并于1999年采用痛痹颗粒的组方治疗膝oa，方中以独活为君药，以祛下焦与筋骨间风寒湿邪；威灵仙舒筋通络止痹痛；淫羊藿、怀牛膝补肝肾，强筋骨，通经络，其中怀牛膝为引经药；当归养血柔肝、舒筋活血；川芎则通达四肢关节，为血中气药；虎杖活血清热解毒，同时防诸药辛燥太过。诸药合用共起补肝肾、祛风湿、化瘀痰之功，冀能消炎止痛，保护软骨。通过36例的临床研究、观察，结果表明本方疗效显著且副作用小。因此有必要对痛痹颗粒治疗骨性关节炎的作用机制尤其是该方对软骨细胞的细胞凋亡与增殖机理做进一步的研究，冀能证实痛

33、痹颗粒的临床疗效，明确其作用机制，并初步探讨本病发病的可能机理，为新药问世提供客观的依据，所以进行设计并立题。1.4本研究达到的科学技术水平，预期社会效益和应用推广前景1.4.1继承和发扬祖国医学，保持中医特色，以临床疗效为前提，以实验研究为基础，制造规范化大鼠的膝oa模型，从发病机理探讨本药的作用机制。本实验采用可靠地国际公认的方法复制动物模型，并采用最新的检测指标il-1、tnf、sod、mda、no等，总之本研究基于现代医学对oa发病机制的最新研究成果，从生化、免疫等多个角度多个层次，系统观察并进行归纳总结，确保本课题不但可行而且先进，冀能填补省内外运用中药治疗oa的空白，并希望以此为基

34、础，进一步从细胞水平（包括本药对软骨细胞及细胞凋亡与增殖的影响）研究中药对oa的长久作用及影响，从而达到挤身国际先进水平的目的，让中药真正走向世界。1.4.2目前，中药治疗oa的方法颇多，但大多以临床疗效研究为主，大样本、规范化的研究很少，中医中药治疗机理的研究，虽有涉及，但大多分散且存在一定的重复性，理想的治疗药物尚未问世，具有公认疗效的小儿迁延性腹泻临床治疗方案尚未确立，其疗效评价体系尚需研究确定，尤其是缺少中医药治疗学整体研究思路与方法，使中药复方治疗oa的疗效机理尚未能全面揭示，影响了该领域研究的深入。而痛痹颗粒是在中医理论指导下选用千金要方中独活寄生汤进行加减所得，并采用可靠的实验模

35、型及最新的国际公认的相关指标进行实验研究，观察其对oa的确切疗效及作用机理，这必将对oa的中医理论产生较大影响，同时对临床治疗也起到更好的指导作用，从而产生较好的社会经济效益。随着改革开放的形势发展，以及中国加入wto与国际接轨的进程的不断完善，祖国医学国际地位不断的提高，我们将从祖国医学宝库中发掘出的治疗oa的高效药物与现代新技术、新方法进行研究总结，从而为人类造福，为振兴中医事业做出应有的贡献。2.科研假说或技术构想：主要内容、技术关键目的，技术特征及创新之处，开发项目应说明开发规模。2.1主要内容2.1.1探讨oa的病因病机，提出新见解，发展中医理论。2.1.2运用现代科学技术，开展实验

36、研究，从分子生物学、免疫学、生理生化学等多方面来探讨“痛痹颗粒”治疗膝oa的疗效机制及药理毒理作用。2.2主要技术关键2.2.1膝oa模型的复制目前所使用的oa动物模型一般可分为两大类，其一是诱发模型，即通过各种操作方法如制动、手术、关节内注药、关节内植入软骨碎片或微粒等诱导oa产生；另一类为自发模型，即不用任何外界干预，动物自发oa，如c57黑鼠等。在选择动物模型时一般应考虑动物的种属（包括其生活习性、关节结构、组织学及病理学特征）、不同方法的造模机制和oa模型的特点，并应参照研究目的加以选择。在诱发模型中，常用的方法是手术造成关节的应力改变及关节腔内注入木瓜蛋白酶， 这两种方法都能复制出较

37、成功较高的oa模型，且操作较为简单。具体的造模机制在于低应力可以造成软骨厚度减少，so染色变淡，水分增加，蛋白聚糖聚集度损伤等变化，木瓜蛋白酶作为一种蛋白水解酶会引起关节软骨的退行性改变。在具体的造模过程中我们选用以上两种方法来分别复制动物模型。用于动物模型的动物一般有狗、兔、鼠等，我们选用大鼠做oa模型，因为该模型关节软骨退变的组织学特征与人类相似，且动物来源较广泛，且经济。2.2.2关节软骨细胞的获取和培养基于来源广泛，操作可行的原则，目前用于体外培养的软骨细胞一般均为兔关节软骨细胞原代培养所得。软骨需在严格无菌的条件下分离，经过一系列的漂洗、消化等工作后获取软骨细胞。目前还没有专门用于软

38、骨细胞培养的培养液，国外采用的培养液种类繁多，有199、1640、f12、改良eagle等，国内的有199、1640、dmem（高糖）等，其中加入胎牛血清（占15%），一般以使用dmem培养液居多。在培养液中还含有一些辅助添加剂，包括25mmol/l hepes、1mmol/l 丙酮酸钠、2mmol/l 谷氨酰胺、50umol/l 二硫基乙醇以及10万单位/l的青霉素和10万单位/l的链霉素，ph7.4。培养过程中一般使用5%co237的恒温培养箱。2.2.3采用的检测手段及指标在病理组织形态学的检查中，一般采用以下几个观察指标：大体肉眼观察软骨及滑膜表面情况；he染色观察有关的形态变化；ma

39、sson三色染色观察胶原的变化；sanfranin-o即沙红o染色用于组织学评分，评分方法按mankin法；电镜下观察软骨细胞内结构形态变化及其周围胶原纤维的变化。在细胞培养的相关检测中，我们采用mtt法检测软骨细胞的增殖能力，用全自动生化分析仪对检测总蛋白含量，使用细胞流式仪进行细胞凋亡的测定，对inos、no含量的测定则使用分型nos试剂盒和no试剂盒。2.3目标（达到的主要技术指标或技术经济指标）、技术特征及创新之处。现代科学技术与中医药理论相结合，深入研究中医药治疗oa的作用机制，为临床应用提供更加科学有利的客观依据，发挥中医药治疗oa的特色和优势，为临床常见、严重影响人类健康的oa研

40、究出有效、安全、便于推广应用的中医药治疗方法，使能迅速缓解症状，大大减轻病人痛苦，降低膝骨关节炎的致残率和复发率，且副作用小的简、便、廉、验的中药制剂问世。治疗膝oa的新药生产及对其在治疗中所起作用机制的深入探讨，既符合国情又能够走向世界，产生较大的社会和经济效益，这必然形成高新技术产业进入高新领域，对促进科技进步，发展中医药，有着积极的作用，同时这也是中药现代化研究的发展方向和新的探索。3.实验研究方法及技术路线。3.1对实验性大鼠骨性关节炎的防治作用 oa模型的制备：（1）取sd雄性大鼠50只，体重200220g，固定，常规备皮消毒，沿髌韧带内侧缘切口，切断双后肢内侧副韧带及膝前内侧筋膜扩

41、张部，并在断端处修剪去除约2mm，造成双后肢膝外翻畸形。术后第二天放造模大鼠于拖箱内每天赶其行走30m。（2）取sd雄性大鼠50只，体重200220g，4%木瓜蛋白酶溶液与0.03mol/l半胱氨酸溶液1：1混置0.5小时后，分别在第1、3、5、7天于实验大鼠膝关节腔内注入混合液20ul。方法：将造模后的大鼠随机分为模型组、阳性对照组（维骨力组）、治疗组，另设正常对照组，分别灌胃给药或蒸馏水，连续7周。七周后将动物麻醉后，立即将大鼠以仰卧位固定，颈总取血，接入试管中，2000rmp15min离心获取含药血清；切开关节囊，进行大体观察后，然后以锐利刀片切取膝关节前正中部分的滑膜组织，作he染色，

42、电镜下观察。再用锐利刀片切取股骨内倮软骨使其呈2mm×1mm全层软骨标本，2.5%戊二醛溶液固定，电镜下观察。所余之股骨内倮连同软骨下骨一并切下，10%福尔马林溶液固定24小时以上，分别作he、沙红-o及masson三色染色后光镜检查，取样后即可将动物处死。观察指标：大体肉眼观察软骨及滑膜表面情况；he染色观察有关的形态变化；masson三色染色观察胶原的变化；sanfranin-o即沙红o染色用于组织学评分，评分方法按mankin法（附评分等级表如下）；电镜下观察软骨细胞内结构形态变化及其周围胶原纤维的变化。评分等级.结构正常 0表面结构微小不规则 1表面结构中等不规则 2表面结构

43、严重不规则 3过渡层出现裂隙 4辐射层出现裂隙 5钙化层出现裂隙 6过渡层消失 7辐射层消失 8钙化层消失 9结构完全破坏 10.细胞1. 切线的区域正常 0细胞肿胀 1细胞消失 22. 过渡和辐射的区域正常 0少量的细胞增多 1中等量的细胞增多 2大量的细胞增多 3少量的克隆 4中等量的克隆 5大量的克隆 6少量的细胞减少 7中等量的细胞减少 8大量的细胞减少 9细胞消失 10.变异标记 完整 0多层 1模糊 2血管的交叉 3.血管翳形成没有 0少量 1中等量 2大量 33.2 对体外培养兔膝关节软骨细胞的影响 3.2.1 兔膝软骨细胞的原代培养 无菌条件下取两周龄新西兰白兔后肢关节，用刀片

44、取关节表面软骨，收集在含磷酸缓冲液（pbs）的无菌小培养皿内，反复清洗除去软骨片表面的血液，以及可能勿带之滑膜组织。漂洗完毕后，用无菌的眼科小剪刀在培养皿中将其细切至不大于1mm3。切碎后将其装入10u试管内，按1：10量加入消化酶类进行化学解离。先用0.25%胰酶消化30min，然后去除胰酶，加入0.2%胶原酶消化78小时后，1500rpm10min离心，弃上清，加入pbs，摇匀在同上离心弃上清，在加pbs反复三次，最后一次加含15%胎牛血清dmem培养液，用吸管轻轻吹打均匀，200目筛网过滤，放入培养瓶中， 5%co237培养箱培养，定期换液，并观察照相，长满后用0.25%胰酶消化传代。3

45、.2.2 对软骨细胞增殖反应的作用 将在培养瓶中长满的细胞消化，接入96孔培养板中，100ul/孔， 待细胞长成单层后，将旧液弃去，用pbs轻轻荡洗一遍，然后加入含药血清，100ul/孔，每组4个复孔。二氧化碳恒温培养箱孵育72h后，取上清液。每孔加入mtt试剂20ul（5g/l）既无血清培养液100ul，再孵育4h。取上清，每孔加入200ul溶甲瓒液，以主波长570nm，参比波长690nm于酶标仪上比色，读取吸光度（a）值。3.2.3 对软骨细胞的细胞凋亡的影响 单层细胞培养板制作同上，加入含药血清，每组4个复孔，于5%co237培养箱中培养48h，弃去旧液，用0.25%胰酶消化待细胞有变圆

46、趋势即取出消化液，加入pbs，用吸管轻轻吹打，使成单个细胞悬液，移入离心管离心，1000rpm，5min，去掉上清液，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散，用细滴管或注射器将细胞迅速注入4冷乙醇中（乙醇终浓度为70%），用细胞流式仪检测凋亡细胞数目，计算凋亡百分率。3.2.4 对软骨细胞蛋白合成和no含量的影响 同样将各组含药血清加入已长成单层细胞的培养板内，co2恒温培养箱培养48h后，收集上清液，用全自动生化分析仪检测总蛋白含量，用分型nos试剂盒和no试剂盒检测各组inos、no含量。3.2.5 拆方后对软骨细胞的影响 进行拆方实验，筛选出补肝肾组方、祛风湿组方和化瘀痰组方三组，对

47、这三组及复方分别进行体外的软骨细胞实验，设立阳性对照组（维骨力组）：细胞毒性实验 将各组方药液用培养基分别配成几个待测浓度，加入已长成单层细胞的培养板内，分别观察24h、48h、72h细胞形态的变化，选择细胞不发生变圆、萎缩、漂浮的最大浓度为药物对细胞的最大无毒浓度，以便继续实验。对软骨细胞的细胞凋亡、增殖、no含量及inos基因表达的影响 将各组方药液分别配置成最大无毒浓度，加入已长成单层软骨细胞的细胞培养板内，具体检测操作则同加入含药血清的实验。4.现有工作条件和基本条件本课题主要承担者是江苏省中医院临床医学研究所。本所具有江苏省科学技术委员会，江苏省标准局颁布的动物饲育环境合格证书，动物质量合格证书，人员素质高，均拥有实验动物从业人员岗位证书。仪器设备先进完善，拥有无菌室，能够进行细胞培养及指标检测等一系列工作，具有较强的科研能力。本组方的提供者是本院的风湿科，该科拥有专科病房（20张病床）及全天