环磷酰胺和环孢素A对SLE患者外周血Th细胞亚群免疫调节的作用

1、环磷酰胺和环孢素A对SLE患者外周血Th细胞亚群免疫调节的作用 作者：姜玉章* , 季晓辉, 李玉峰, 李媛媛【摘要】 目的: 探讨环磷酰胺(CY)和环孢素A(CsA)对SLE患者外周血Th细胞亚群的免疫调节作用。方法: 以10例重度活动的SLE患者和6例正常对照的PBMC为研究对象, 将细胞悬液分为空白组、 植物血凝素(PHA)刺激组、 PHA+CY组、 PHA+CsA组、 CY组和CsA组分别给药, 体外细胞培养24 h后, 利用三色流式细胞术检测CD4+IL10+T细胞、 CD4+IFN+T细胞比例和CD8+ IL10+ T细胞、 CD8+IFN+T细胞等比例, 同时记录相应细胞的荧光强

2、度。结果: CsA促进静息和活化状态下PBMC培养中表达CD4+IL10+T细胞比例增加, 同时CD4+T细胞表达IL10荧光强度增强。CY虽然促进SLEPBMC培养中表达CD4+IL10+T细胞比例增加, 但对CD4+T细胞表达IL10的荧光强度无明显增强。CsA抑制PBMC培养中表达CD8+IL10+T细胞的比例, 同时CD8+T细胞表达IL10的荧光强度减弱。而CY虽然抑制SLE PBMC培养中表达CD8+IL10+T细胞的比例, 但CD8+T细胞表达IL10的荧光强度却是减弱的。CsA对活化状态下正常对照和SLE PBMC培养中表达CD4+IFN+T细胞比例的抑制作用优于CY, 且CY

3、对SLE患者PBMC培养中CD4+T细胞表达IFN荧光强度抑制作用也是减弱的。CsA和CY均可抑制活化状态下, 正常对照PBMC和静息状态下SLE PBMC培养中表达CD8+IFN+T亚群细胞的比例, 且CY的抑制作用优于CsA。但CY对SLE PBMC培养中CD8+T细胞表达IFN荧光强度的增强作用不如CsA。结论: CsA和CY均能使CD4+T细胞受抑, CD8+T细胞上升。但CsA对T细胞活化, 炎症相关细胞因子表达启动的反应更为敏感, 免疫调节作用更为显著。 【关键词】 环磷酰胺 环孢素A 红斑狼疮 系统性 流式细胞术SLE是一自身免疫性疾病, 其致病机制不仅涉及B细胞、 各种亚群T细

4、胞（Th1, Th2）及树突状细胞（dendritic cells, DC）, 还涉及复杂的细胞因子网络1, 2。目前SLE的治疗仍以糖皮质激素（glucocorticoid, GC）及环磷酰胺（cyclophosphamide, CY）等为主, 环孢素A(cyclosporine A, CsA)及霉酚酸酯(mycophenolate mofetil, MMF)等新型免疫抑制剂治疗SLE及相关疾病亦偶见报导3。但对CsA、 MMF和CY等免疫抑制剂治疗SLE的药理作用具有针对性的实验研究国内外罕见报导4。因此, 本研究中以SLE患者外周血单个核细胞（peripheral blood monon

5、uclear cells, PBMC）为研究对象, 探讨CsA、 CY两种免疫抑制剂对CD4+和CD8+细胞亚群的作用, 探讨CsA、 CY对SLE各个重要免疫病理环节的影响, 为临床合理用药提供实验依据。1 材料和方法1.1 研究对象 10例活动性SLE患者来源于本院风湿科、 肾内科和血液科, 为本院2003-10/2004-08确诊患者, 均符合美国风湿病学会1997年推荐的SLE分类标准。6例正常对照来源于健康献血员。除1 例SLE患者为男性、 年龄为28岁外, 其余9例均为女性, 年龄1355(28±6)岁。健康对照者6例, 均为女性, 年龄2237(30±3)岁。

6、1.2 试剂 Ficoll分离液购自上海华精生物高科技有限公司。CY(1.0 g/支)购自Sigma公司（批号091K1176）, 临用前用RPMI1640溶解。CsA(5 mg/支)购自Sigma公司（批号093K4020）, 临用前用无水乙醇溶解。PHA购自广州生物制品公司, 用RPMI1640配成浓度为1 g/L的工作液。藻红蛋白(PE)Cy5标记的抗CD4单克隆抗体(mAb)(鼠抗人IgG1, , RPAT4克隆); PE标记的抗IL10 mAb(兔抗人IgG1, , JES39D7克隆); 异硫氰基荧光素(FITC)标记的抗IFN(鼠抗人IgG1, , 4S.B3克隆); PE标记的

7、小鼠IgG1同种型对照免疫球蛋白(MOPC21克隆); FITC标记的小鼠IgG1同种型对照免疫球蛋白（MOPC21克隆); 蛋白质转运抑制剂、 破膜剂及固定剂均购自Bioscience公司。1.3 方法1.3.1 PBMC分离培养 采集患者肝素抗凝血10 mL, 轻轻铺于Ficoll分离液上(抗凝血与分离液体积比为21), 2300 r/min离心20 min, 吸出中间细胞层（即PBMC）, 用RPMI1640培养液(含100 mL/L胎牛血清, 青霉素100 U/mL, 链霉素100 U/mL)调整细胞密度为1×109/L, 加于24孔培养板中, 每孔1 mL细胞悬液。将细胞悬

8、液分为空白组、 植物血凝素(PHA)刺激组、 PHA+CY组、 PHA+CsA组、 CY组和CsA组共6组, 在不同组中加入相应试剂, 其中CY至终浓度为160 mol/L, CsA至终浓度为120 mol/L, PHA至终浓度为10 mg/L, 空白组加入相应量的RPMI1640培养液。将细胞置于37、 50 mL/L CO2培养箱中培养24 h后, 1500 r/min离心5 min, 收集细胞进行流式细胞术检测。1.3.2 IFN阳性和IL10阳性细胞亚群检测 应用三色流式细胞仪(EPICS XL Beckmancoulter公司), 根据前向散射光(FS)和侧向散射光(SS)以淋巴细胞

9、群设门, 并对FL1、 FL2和FL3通道设置荧光补偿后, 对CD4+T细胞和CD8+T细胞释放IL10和IFN的情况进行检测, 同时记录荧光强度。每一样本淋巴细胞门内检测10000个细胞。1.3.3 统计学分析 SLE组与正常对照的不同药物刺激组间差异比较用SPSS11.5软件进行独立样本t检验; 同一药物处理组内与静息状态比较行配对t检验分析, 同一组内与未用药比较行配对t检验。2 结果2.1 CsA及CY对SLE和正常对照PBMC培养中表达IL10的CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群比例的影响 与正常对照相比, SLE PBMC培养中表达CD4+ IL10+T细胞比例均增高, 在PHA刺

10、激（即活化状态）下, 其比例进一步增加(表1)。CsA和CY均可抑制正常对照和SLE患者活化状态下PBMC培养中表达CD4+ IL10+T细胞比例增多（P<0.05）。CY抑制正常对照和SLE患者PBMC培养中在PHA未刺激状态下（静息状态下）表达CD4+ IL10+T细胞比例增加的作用优于CsA, 相反, CsA对活化状态下正常对照和SLE患者PBMC培养中表达CD4+ IL10+T细胞比例增加的抑制作用优于CY。与正常对照相比, SLE PBMC培养中表达CD8+IL10+T细胞比例均升高, PHA刺激可使其增高（P<0.05）。CsA和CY均可抑制活化状态下正

11、常对照PBMC培养中表达CD8+IL10+T细胞比例增多, 且CsA的抑制作用优于CY。相反, CsA和CY均刺激活化状态下SLE PBMC培养中表达CD8+ IL10+T细胞比例的增加（P<0.05）, 且CY的刺激作用强于CsA。CY抑制静息状态下正常对照和SLE患者PBMC表达CD8+ IL10+T细胞比例增加的作用优于CsA。表1 CsA及CY对SLE和正常对照PBMC培养中表达IL10的T细胞亚群比例的影响（略）aP<0.05与未经PHA刺激组比较; cP<0.05与正常对照相应处理比较; eP<0.05与未用药相应组相比.（C

12、D4+ IL10+T细胞为CD4+ IL10+IFN+与CD4+ IL10+ IFN-之和, CD8+IL10+T类推）.2.2 CsA及CY对SLE和正常对照PBMC培养中CD4+和CD8+T细胞亚群表达IL10荧光强度的影响 与正常对照相比, SLE PBMC培养中CD4+T细胞表达IL10的荧光强度均增高, PHA刺激可使其进一步增加(表2)。CsA可促进活化状态下SLE和正常对照PBMC培养中CD4+T细胞表达IL10的荧光强度的增加（P<0.05）, 而CY则抑制静息状态下SLE PBMC培养中CD4+T细胞表达IL10的荧光强度的增加（P<0.05）。与

13、正常对照相比, 静息状态下自发分泌项（即空白对照项）和CY的SLE PBMC培养中CD8+T细胞表达IL10的荧光强度增高, 而CsA下降（P<0.05）。PHA刺激可使正常对照自发分泌项和CY的PBMC培养中CD8+T细胞表达IL10的荧光强度的增加（P<0.05）, 而正常对照的CsA和SLE的自分泌项、 CY的PBMC培养中CD8+T细胞表达IL10的荧光强度却是下降的（P<0.05）。表2 CsA及CY对SLE和正常对照PBMC培养中T细胞亚群表达IL10荧光强度的影响（略）aP<0.05与未经PHA刺激组比较; cP&l

14、t;0.05与正常对照相应处理比较; eP<0.05与未用药相应组相比.（CD4+ IL10+T细胞为CD4+ IL10+IFN+与CD4+ IL10+ IFN-之和, CD8+IL10+T类推）.2.3 CsA及CY对SLE和正常对照PBMC培养中表达IFN的CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群比例的影响 与正常对照相比, SLE PBMC培养中表达CD4+IFN+T细胞比例有所增高(表3), PHA刺激可使其进一步增高（P<0.05）。CsA和CY可显著抑制活化状态下SLE患者PBMC培养中表达的CD4+IFN+T细胞比例的增加。同时CsA对活化状态下正常对照和S

15、LE PBMC培养中表达的CD4+IFN+T细胞比例增加的抑制作用优于CY。与正常对照相比, 在活化状态下SLE PBMC培养中表达的CD8+IFN+T细胞比例升高, PHA刺激可使其增高（P<0.05）。CsA和CY可抑制活化状态下, 正常对照PBMC和静息状态下SLE PBMC培养中表达CD8+IFN+T亚群细胞比例增多, 且CY的抑制作用优于CsA。相反, CsA和CY均刺激活化状态下SLE PBMC培养中表达CD8+IFN+T细胞比例的增加（P<0.05）, 且CY的刺激作用强于CsA。而在正常对照中CY抑制活化状态下PBMC表达CD8+IFN+ T细胞比例

16、作用增加优于CsA。表3 CsA及CY对SLE PBMC培养中表达IFN不同T细胞亚群比例的影响（略）aP<0.05与未经PHA刺激组比较; cP<0.05与正常对照相应处理比较; eP<0.05与未用药相应组相比.（CD4+ IL10+T细胞为CD4+ IL10+IFN+与CD4+ IL10+ IFN-之和, CD8+IL10+T类推）.2.4 CsA及CY对SLE和正常对照PBMC培养中CD4+T细胞和CD8+T细胞表达IFN荧光强度的影响 与正常对照相比, SLE PBMC培养中CD4+T细胞表达IFN的荧光强度变化不一致(表4)。但PHA刺激可

17、使SLE和正常对照PBMC培养中CD4+T细胞表达IFN的荧光强度进一步增加。CsA可促进SLE和正常对照PBMC培养中CD4+T细胞表达IFN的荧光强度的增加, 而CY则对SLE PBMC培养中CD4+T细胞表达IFN的荧光强度影响无统计学意义（P>0.05）。与正常对照相比, 静息状态下, SLE自发分泌项PBMC培养中CD8+T细胞表达IFN荧光强度增高, 而PHA刺激项SLE PBMC的CD8+T细胞表达IFN的荧光强度反而下降。但正常对照PBMC培养中CD8+T细胞表达IFN的荧光强度下降无统计学意义。表4 CsA及 CY对SLE和正常对照PBMC培养中CD8+T细胞表

18、达IFN荧光强度的影响（略）aP<0.05与未经PHA刺激组比较; cP<0.05与正常对照相应处理比较; eP<0.05与未用药相应组相比.（CD4+ IL10+T细胞为CD4+ IL10+IFN+与CD4+ IL10+ IFN-之和, CD8+IL10+T类推）.3 讨论 目前SLE的治疗仍以CG为主, 对重症患者加用免疫抑制剂(如CY、 CsA或MMF)。CY是一种细胞周期非特异性免疫抑制剂, 主要作用于有大量DNA复制的增殖期细胞。CsA为钙调磷酸酶拮抗剂, 其作用机制在于抑制T细胞活化核调控因子(NFAT)的活化和核转位。因而与CY不同, C

19、sA能在T细胞早期活化阶段发挥作用, 抑制T细胞的炎性细胞因子的表达。 本研究中, 在静息和活化状态下, SLE PBMC培养表达CD4+IL10+T细胞比例增加, 同时CD4+T细胞表达IL10的荧光强度增强。CsA刺激静息和活化状态下PBMC培养表达CD4+IL10+T细胞比例增加, 同时CD4+T细胞表达IL10荧光强度增强。CY虽然促进CD4+IL10+T细胞比例增加, 但对CD4+T细胞表达IL10的荧光强度增加作用不明显。CsA抑制表达CD8+IL10+T细胞比例, 同时CD8+T细胞表达IL10的荧光强度增强。而CY虽抑制表达CD8+IL10+T细胞比例, 但CD8+T细胞表达I

20、L10的荧光强度减弱。CsA和CY可显著抑制活化状态下PBMC培养中表达的CD4+IFN+T细胞比例, 同时CD4+T细胞表达IFN荧光强度也增高。CsA对活化状态下正常对照和SLE PBMC培养中表达的CD4+IFN+T细胞比例的抑制作用优于CY, 且CY对CD4+T细胞表达IFN荧光强度也是减弱的。与之相反, CsA和CY可抑制活化状态下, 正常对照PBMC和静息状态下PBMC培养中表达CD8+IFN+T亚群细胞比例, 且CY的抑制作用优于CsA。但CY对SLE PBMC培养中CD8+T细胞表达IFN荧光强度的增强作用不如CsA。 由此可见, 两药均能干扰SLE的免疫紊乱环节, 对炎症相关

21、细胞因子表达异常起到一定的修正作用1, 但CsA能在T细胞早期活化阶段发挥作用, 抑制T细胞的炎性细胞因子的表达, 这可能是CsA表现优于CY的原因之一; 另依Su等4研究报道MMF同样可使SLE 患者IL10、 IFN及IL12异常增高的表达水平降低, 并抑制表达IL10和表达IFN的CD4+T细胞比例, 而地塞米松却使IL10表达水平增高, 对IFN、 IL12无明显影响, 因此推测, CsA具有MMF的部分优势, 这是CG及CY所不具备的。 另本研究还观察到一个令人感兴趣的现象, 即CsA及CY的应用可使PHA刺激下活化的T细胞中表达IL10或IFN的CD8+T细胞比例明显增高。这可能与CD4+T细胞亚群受到抑制有关。Wang等5发现SLE患者应用CG治疗病情好转, 但其CD8+T细胞增高, 或CD4+T细胞明显下降而CD8+T细胞减少不明显, 甚至出现CD4+/CD8+比例倒置, 这可能与CD8+T细胞的抑制性调节作用有关。即免疫抑制治疗, 有助于抑制CD4+T细胞过度活化引起的异常自身免疫反应, 帮助CD8+T细胞发挥调节作用, 控制CD4+T细胞, 实现病理状态下的免疫稳定。【参考文献】 1 姜玉章, 季晓辉, 李玉峰, 等. 体外环磷酰胺和环孢素A对系统性红斑狼疮患者细胞因子释放及Th细胞亚群的作用研究J. 中华风湿病学杂