浸矿微生物硫酸盐同化与重金属抗性耦合作用机制的研究

1、浸矿微生物硫酸盐同化与重金属抗性耦合作用机制的研究 我国矿产资源的显著特点是品位低、复杂、难处理和中小型矿居多 , 传统的 选冶工艺很难进行经济、绿色、有效地提取。生物冶金具有低本钱、短流程、污 染小等优点 , 具有广阔的应用前景。浸矿微生物浸出一段时间之后 , 其生长的环境中就会富含高浓度的硫酸盐及 有毒重金属离子 , 这是制约其浸出时间、浸出效率的重要的环境因素。而在微生 物的解毒机制中 ,硫酸盐的同化途径可能发挥了重要的作用 , 因而对于浸矿微生 物重金属的抗性机制 , 以及硫酸盐同化与重金属解毒耦合作用机制的研究 ,对微 生物适应极端环境的分子机制的揭示 , 对浸矿过程中 , 重金属的

2、耐受和浸矿效率 的提高, 以及在环境领域更广阔的应用其抗性机制 ,都将具有非常重要的意义。本文旨在对浸矿微生物的重金属抗性机制进行深入的探索 , 研究浸矿微生物 的重金属抗性以及与硫酸盐同化的内在联系，研究工作主要有以下几个方面： 浸矿微生物重金属抗性机制的初步探索在本研究给定的重金属浓度下 , A. ferooxidans 表现出了明显的抑制作用并且随着重金属浓度的增加 , 抑制作用越 明显。适合研究的Cd2+Zn2+、Pb2+三种重金属耐受浓度分别为 Cd2+5mM15mM 30mM, Zn2+150mM、300mM、600mM, P b2 +2.5mM、5mM、 10mM。在Cd2+办迫

3、下,通过测定镉离子的亚细胞结构镉离子含量、细菌细胞体内 GSH!勺含量、硫酸根离子浓度、硫酸盐同化途径的相关酶类的酶活,结果说明其可能存在的抗性机制有细胞累积、排出系统、以及生物转化或螯合等几种方式。 在Zn2+胁迫下，通过测定菌体内GSH勺含量、Cys含量、硫酸盐同化途径的相关 酶类酶活,结果说明,随着Pb2+浓度的增加,其体内GSF含量有所增加，Cys含量的 变化不明显 , 硫酸盐同化途径的相关酶类也有所变化 , 但是却是表现为先增加后 降低, 说明硫酸盐同化途径可能对锌离子的抗性有一定的作用 , 但是在浓度更大 的情况下 ,硫酸盐同化途径可能已经不能满足细菌菌体的需要 , 其可能启动了更

4、 多的重金属抗性机制。在Pb2+勺胁迫下，通过测定菌体内GSH勺含量、Cys含量、硫酸盐同化途径 的相关酶类的酶活，结果说明，谷胱甘肽、半胱氨酸的含量，随着Pb2+浓度的增大 而降低,硫酸盐同化相关酶类的活性有所变化但是却与Cd2+勺情况相反,说明Pb2+胁迫菌体情况下硫酸盐同化对抗性的奉献可能不明显,或是与Cd2+H反。 浸矿微生物重金属抗性基因的差异表达分析通过生物信息学的分析 , 发现了十个 可能与重金属抗性相关的基因。利用Real-time PCR技术,对Cd2+办迫下重金属抗性基因的差异表达情况进 行了考查，结果说明，在不同浓度的Cd2+刺激下，重金属抗性基因在转录水平上 的表达量,

5、均呈上调趋势,相对对照组大约上调了 1-8倍,且随着Cd2+浓度的增加， 上调倍数也随之增加。预测Cd2啲转运模型为Czc操纵子是由H+离子梯度驱动, 由位于内膜上的QcA1,2A将重金属Cd(H )泵出到细胞质，然后由CzcB1A,f(?)将 重金属穿梭至外膜 , 并预防重金属进入周质 ,CzcB1A,f 也可以提供其他重金属的 特异性。CzcC1A,f那么完成将重金属排出到外部环境的全过程。CmtR是重金属的转录 调控因子 , 位于胞内 , 作为识别的信号。CadB1A,f和CadB2A,f是转运体,帮助CzcB1A,f将重金属运出体外。在Zn2+ 胁迫下,重金属抗性基因的表达差异情况结果

6、说明,在不同浓度的Zn2+胁迫下, 重金属抗性基因在转录水平上的表达量也是呈上调趋势 , 大约是对照组的 1.2 到 630倍,且随着Zn2+浓度的增加，上调倍数也随之增加，说明这些基因的表达情况, 大局部与Cd2+办迫下情况相似但是CzcABCA重金属排出系统的基因(AFE-0671CzcA1A,f、 AFE-1144CzcA2A,f、AFE-1142CzcC1A,f和 AFE-1143CzcB1A,f)变化不大，说明对 于Zn2+的抗性的奉献可能不是很大，而基因AFE-2437CadB1A,f AFE-2438CadB2A,f AFE-2920CadB3A,f这三个转运蛋白,在Zn2+胁迫

7、下,却是随 着重金属浓度的增大而逐渐增加的 , 说明转运蛋白对于锌离子的抗性奉献较大。 在Pb2+办迫下,重金属抗性基因的表达差异情况研究发现,在不同浓度的Pb2+办 迫下,重金属抗性基因在转录水平上的表达量均呈下调趋势,且随着Pb2+浓度的增加,并没有明显的调控趋势,说明在Pb2+办迫下大多数抗性基因,没有表现出 明显的调控或者为负调控。重金属胁迫下硫酸盐同化途径相关基因的表达差异分析通过生物信息学 分析,找寻到硫酸盐同化的相关的关键基因 ,对其进行体外重组表达和酶活分析 , 确定了硫酸盐同化的根本代谢路径。被运输到体内的硫酸盐被cysDN编码的ATP硫酸化酶激活为APS(ade nos i

8、n e-5 ' -phosphosulfate), 随后被APS复原酶复原 为亚硫酸盐 , 亚硫酸盐又被 cysJI 编码的亚硫酸盐复原酶复原为硫化物 , 最后硫 化物与0-乙酰丝氨酸由cysM编码的半胱氨酸合成酶同化入半胱氨酸。通过对重金属胁迫下硫酸盐同化途径相关基因的表达差异分析 , 结果说明在 Cd2+办迫下，硫酸盐同化的相关基因的表达，表现为上调趋势，大约是对照组的1 到 3 倍, 随着离子浓度的增大 , 上调倍数越大。但是锌离子胁迫下只有少数几个基 因表达上调 , 而铅离子胁迫下 , 那么没有明显的上调。说明硫酸盐同化基因对于镉离子的抗性的较大 , 而对其他两种金属离子那么较

9、小浸矿微生物重金属抗性关键基因的过表达分析研究发现，CysE和CmtR基因 是转录调控作用的关键的抗性基因 , 为了进一步的了解其功能 , 采用过表达分析的方法考查了其转入受体菌之后的抗性的变化。结果说明：在不同浓度Cd2+勺胁迫下,BL21导入重金属抗性基因后，相对于对照组，菌体的生物量，没有明显的 变化，但是其体内Cys和GSM含量却有所增加，同时体内的重金属含量也是有所 增加，说明导入抗性基因后其重金属的抗性明显增强；不同浓度Zn2+ 勺胁迫下,BL21导入重金属抗性基因后,其相应的结果与Cd2+相似,说明导入抗性基因 后其重金属抗性增强；不同浓度 Pb2+勺作用下,BL21导入重金属抗性基因后,无 论是菌体的生物量、Cys和GSH勺含量,还是其体内的重金属含量,相对于对照组 均是降低的 , 说明导入抗性基因后其重金属抗性没有明显的改善或者是下降的。重金属浸出及其种群优势度的分析16S rDNA-RFLP分析结果说明,所选取的三个AMD酸性矿坑水采样点中，均含有Acidithiobacillus菌属的微生物，每个样点均有局部菌株独立于菌株存在 , 独立存在的菌株数目占所考查菌株数 目的一半左右；并且三个样点之间浸矿微生物的种类及数量相似度较大 , 说明这 三个考查点其中的地球化学环境相似。用 AMD寸四种不同组成的矿石浸出后，发 现其