生物制药层析技术

1、LOGO层析技术1李绍军李绍军2 层析技术（层析技术（chromatographychromatography）又称）又称色谱技色谱技术、层离技术术、层离技术等，是一组相关技术的总称。等，是一组相关技术的总称。 层析技术具有分离精度高、设备简单、操作方便等优点，是当前获得高纯度产物最有效的分离纯化技术。主要内容主要内容第一节第一节 概述概述第二节第二节 凝胶层析技术凝胶层析技术5概述概述1、层析基本原理2、层析技术分类3、层析操作过程中一些基本概念和参数4、层析系统的基本组成及基本操作67 当含有被分离物质的料液流过层析柱时，由于层析剂当含有被分离物质的料液流过层析柱时，由于层析剂对各组分的阻

2、滞力不同而使各组分分离开来（不同组分在对各组分的阻滞力不同而使各组分分离开来（不同组分在流动相和固定相分配不同）。流动相和固定相分配不同）。第一节第一节 概概 述述一、层析基本原理一、层析基本原理三通阀三通阀收集器收集器检测器检测器泵泵泵泵流流动动相相料料液液DCBA层层析析柱柱时间（或流出体体积）时间（或流出体体积）流流出出组组分分浓浓度度A B C D（a）层析系统基本组成）层析系统基本组成（b）分离出组分峰图）分离出组分峰图8按流动相按流动相- -固定相分固定相分F气气- -液色谱（液色谱（GLCGLC）F气气- -固色谱（固色谱（GSCGSC）F液液- -液色谱（液色谱（LLCLLC）

3、F液液- -固色谱（固色谱（LSCLSC）按固定相不同分按固定相不同分F柱色谱柱色谱F纸色谱纸色谱F薄层色谱薄层色谱按分离机理不同分按分离机理不同分F吸附色谱吸附色谱F离子交换色谱离子交换色谱F凝胶色谱凝胶色谱F亲和层析亲和层析F疏水层析疏水层析二、层析技术分类二、层析技术分类第一节第一节 概概 述述9三、层析操作过程中一些基本概念和参数三、层析操作过程中一些基本概念和参数料液料液( (各组分各组分)层析柱分离层析柱分离随流动相依次流出随流动相依次流出进入检测器进入检测器响应信号响应信号 色谱图的纵坐标为检测器的响应信号，横坐标为时间或色谱图的纵坐标为检测器的响应信号，横坐标为时间或流动相流出

4、体积。流动相流出体积。时间（或流出液体积）时间（或流出液体积）流流出出组组分分浓浓 度度A B C D1.1.色谱流出曲线色谱流出曲线( ( 色谱图色谱图) ) 102. 2. 体积、时间体积、时间 总柱床体积（总柱床体积（V Vt t）：层析剂经溶胀、装柱、沉降，）：层析剂经溶胀、装柱、沉降，体积稳定后所占据层柱内的总体积。体积稳定后所占据层柱内的总体积。 外水体积（外水体积（V Vo o）：柱中层析剂颗粒间隙的液相体积）：柱中层析剂颗粒间隙的液相体积的总和。的总和。 内水体积（内水体积（V Vi i）：溶胀后的层析剂颗粒网孔中的液）：溶胀后的层析剂颗粒网孔中的液相体积的总和。相体积的总和。

5、 基质体积（基质体积（V Vg g）：干胶体积，是层析剂基质颗粒骨）：干胶体积，是层析剂基质颗粒骨架所占据的体积。架所占据的体积。Vt = Vo十十ViVg11 洗脱时间洗脱时间( (或保留时间或保留时间)(te)(te)：从洗脱开始，某一成：从洗脱开始，某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值( (洗脱峰最高点洗脱峰最高点) )时的时间。时的时间。 洗脱体积洗脱体积(Ve)(Ve)：从洗脱开始，某一成分从柱顶部到底：从洗脱开始，某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值部的洗脱液中出现浓度达到最大值( (洗脱峰最高点洗脱峰最高点)

6、 )时时的流动相体积。的流动相体积。12 死体积死体积( (V Vm m) )：指不被层析柱层析剂滞留的惰性组分，从：指不被层析柱层析剂滞留的惰性组分，从开始洗脱到柱出口出现浓度最大值时流出的流动相体积开始洗脱到柱出口出现浓度最大值时流出的流动相体积。其值等于外水体积加内水体积。其值等于外水体积加内水体积。 死时间死时间( (t tm m) )：指不被层析柱层析剂滞留的惰性组分，从：指不被层析柱层析剂滞留的惰性组分，从开始洗脱到柱出口出现浓度最大值所需的时间。其值等开始洗脱到柱出口出现浓度最大值所需的时间。其值等于流动相流过层析柱所需的时间。于流动相流过层析柱所需的时间。 调整保留时间调整保留

7、时间( (t te e t tm m) )： 保留时间扣除死时间的值。保留时间扣除死时间的值。1314峰高（峰高（H H）：色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高。）：色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高。峰宽峰宽(W)(W)和半峰宽和半峰宽(W(W1/21/2):):峰宽是通过色谱峰的拐点作切线在峰宽是通过色谱峰的拐点作切线在峰底部的截距。半峰宽是洗脱峰高一半时的宽度。峰底部的截距。半峰宽是洗脱峰高一半时的宽度。峰面积峰面积(A):(A):峰与峰底之间的面积称为峰面积。峰与峰底之间的面积称为峰面积。 3. 3. 峰高、峰面积和峰宽峰高、峰面积和峰宽15分离度分离度(R)(R)又称分辨率，是

8、相邻两个洗脱峰保留时间之又称分辨率，是相邻两个洗脱峰保留时间之差的差的2 2倍与色谱峰峰基宽之和的比值，表示式为：倍与色谱峰峰基宽之和的比值，表示式为：R R = = 2 2（t te2e2t te1e1）（WW1 1 + + WW2 2） R1R1时，两峰部分重叠；时，两峰部分重叠；R=1R=1时，两峰有时，两峰有98%98%的分离；的分离；R=1.5R=1.5时，两峰分离程度可达时，两峰分离程度可达99.7%99.7%。因此，一般用因此，一般用R=1.5R=1.5作为两种组分完全分离的标志。作为两种组分完全分离的标志。 4. 4. 层析柱的分离度层析柱的分离度 式中：式中：te2 和和te

9、1洗脱峰洗脱峰2和峰和峰1的保留时间；的保留时间； W1 和和W2 洗脱峰洗脱峰1和峰和峰2的峰宽。的峰宽。16它们之间的换算关系为：它们之间的换算关系为：体积流速（体积流速（mL/mimmL/mim） = = 线性流速（线性流速（cm/hcm/h）层析柱截面积（层析柱截面积（cmcm2 2）/60/60。 5. 5. 流速的表示法流速的表示法在放大过程中应保持在放大过程中应保持线性流速线性流速不变；而增加不变；而增加体积流速体积流速将将随随层析柱截面层析柱截面积积的增大而增加。的增大而增加。流速有流速有线性流速线性流速(cm/h)(cm/h)和和体积流速体积流速(mL/min)(mL/min

10、)。176. 6. 柱效柱效 柱效柱效是表达层析柱性能的重要参数，可用是表达层析柱性能的重要参数，可用理论塔板数理论塔板数N N和和理论塔板高度理论塔板高度H H来衡量来衡量。 N=5.54 (te/W1/2)2H=L/N 理论塔板数越理论塔板数越大大或理论塔板高度越或理论塔板高度越小小，说明层析说明层析柱分离效率越柱分离效率越高高。18四、柱层析系统的基本组成及基本操作四、柱层析系统的基本组成及基本操作F层析柱层析柱+ +层析剂层析剂F上样洗脱系统上样洗脱系统F检测系统检测系统F收集系统收集系统1.1.柱层析系统的基本组成柱层析系统的基本组成三通阀三通阀收集器收集器检测器检测器泵泵泵泵流流动

11、动相相料液料液DCBA层层析析柱柱19时间（或流出体体积）时间（或流出体体积）流 出流 出组 分组 分浓度浓度A B C D 层析剂选择和预处理层析剂选择和预处理 装柱装柱 平衡平衡 上样上样 洗脱洗脱 检测检测 收集收集层析剂再生和保存层析剂再生和保存2.2. 柱层析的基本操作柱层析的基本操作第二节第二节凝胶层析技术凝胶层析技术1、定义2、应用3、原理4、凝胶的结构和性质5、凝胶层析的生产条件和操作6、凝胶层析的应用2021gel filtration chromatography,GFC一、一、定义定义凝胶层析（凝胶层析（gel chromatography）也称：也称： 分子筛层析分子筛

12、层析 分子排阻层析分子排阻层析 凝胶过滤凝胶过滤 凝胶色谱等凝胶色谱等二、二、应用应用l凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。l分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。l利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、去热源和脱色。三、三、原理原理凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；相对分子质量较小的物质可自由地进出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。中等大小的分子在大分子物质与小分子物质之间被洗脱

13、。这样，经过层析柱，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。带网孔的带网孔的葡聚糖珠葡聚糖珠小分子进小分子进入葡聚糖入葡聚糖珠内珠内大分子不大分子不能进入珠能进入珠内，经珠内，经珠之间缝隙之间缝隙流出流出固定相（凝胶）固定相（凝胶）三维空间网状结构样品样品固固定定相相流流动动相相小分子小分子被延滯被延滯小分子小分子大分子大分子较快流出较快流出分子筛效应分子筛效应： 按分子大小不同按分子大小不同, ,在凝在凝胶受到的胶受到的阻滞作用阻滞作用有差异有差异, ,从从而造成各组分在凝胶柱中的而造成各组分在凝胶柱中的迁移速度不同得到分离。迁移速度不同得到分离。 1、比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部

14、，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出； 2、较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出； 3、分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间。 凝胶过滤层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析过程示意凝胶过滤层析过程示意图图小分子小分子大分子大分子凝胶基质凝胶基质凝胶珠凝胶珠 分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。 30（一）平衡排除理论（一）平衡排

15、除理论当溶质层流过一个填料颗料这段距离时，溶质分子已多次进出于填料的孔，达到平衡。平衡条件只是在流速很慢时的一个极端情况。31（二）（二）扩散分离理论扩散分离理论 溶质分子在流经色谱柱的过程中，在流动相和固定相之间没有达到平衡，存在着流速依赖性。聚苯乙烯和苯乙烯样品淋出曲线的流速依赖性聚苯乙烯和苯乙烯样品淋出曲线的流速依赖性1 1流速为流速为0.65ml/min0.65ml/min；2 2流速为流速为2.0ml/min2.0ml/min溶剂为甲苯溶剂为甲苯 32（三）（三）流动分离理论流动分离理论 红细胞在毛血细管中流动时比血浆流得快。 较大的分子较先通过或绕过这个填料颗粒，使溶质能按其大小进

16、行分离。 33分离过程分离过程三种不同分子量物质的混合样品用某种规格的凝胶柱进行分离。样品加入，以水或其他溶液进行洗脱，即得洗脱曲线 。34分离过程分离过程最先流出物质A，A分子量最大，完全不能进入颗粒内部，只能从颗粒间隙流过， “全排阻”。其流经体积最小，等于外水体积V0。最后流出物质C，它分子量最小，其分子可以自由进出凝胶颗粒， “全渗入”。流经体积是外水体积与内水体积之和V0+Vi。物质B分子量介于渗入限与排阻限之间，其分子能够部分地进入凝胶颗粒中。 “部分排阻”或“部分渗入”。流径体积Ve是全部外水体积加上内水体积的一部分，即Ve=V0+KdVi 35分配系数分配系数Kd排阻系数：当K

17、d=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。0Kd1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。36凝胶层析的特点凝胶层析的特点（1）凝胶层析操作简便，所需设备简单。（2）分离效果较好，重复性高。（3）分离条件缓和。（4）应用广泛。（5）分辨率不高，分离操作较慢。37四、四、凝胶的结构和性质凝胶的结构和性质 一、葡聚糖凝胶 (Sephadex)二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex)三、聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P）四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas)六、疏水性凝胶（hydr

18、ophobic gels） 38（一一）、）、葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 (Sephadex)商品名为Sephadex G类。交联葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。再经3-氯-1，2-环氧丙烷为交联剂，形成三维网状结构的高分子化合物。其交联度是通过交联剂的加量及反应条件来控制的。 交联葡聚糖凝胶的化学结构交联葡聚糖凝胶的化学结构 葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大

19、。 G G类葡聚糖凝胶常用类葡聚糖凝胶常用G-XG-X代表，代表，X X数字既代表交联度，也数字既代表交联度，也代表特水量。代表特水量。X X数字越小，交联度越大，网孔越小，适用于数字越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。分离低分子质量生化产品。X X数字越大，交联度越小，网孔数字越大，交联度越小，网孔越大，适用于分离高分子生化产品。越大，适用于分离高分子生化产品。X X数字也代表凝胶的持数字也代表凝胶的持水量，水量，如如G-25G-25表示表示1g1g干胶持水干胶持水2.5mL2.5mL，G-100G-100表示表示 1g1g干胶持干胶持水水10mL10mL，依次类推。，

20、依次类推。41Sephadex G编号意义： 1、吸液量； 2、溶涨时间； 3、凝胶孔径； 4、分离范围 蛋白质、多糖42葡聚糖凝胶性能与编号的关系葡聚糖凝胶性能与编号的关系43葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（G类）的规格类）的规格44葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（G类）特点类）特点1、孔径。2、稳定性。3、吸附作用。4、芳香族化合物和杂环化合物。 1、Sephadex在水、盐、碱、弱酸以及有机溶液中都比较稳定，可以多次重复使用。 2、稳定工作pH为210，强酸溶液和氧化剂会使交联的糖苷键水解断裂。 3、在高温下稳定，可煮沸消毒，在100 C下40 min对凝胶的结构和性能都没有明显的影响。性质与特点性质与

21、特点 4、含有羟基，呈弱酸性，有可能与分离物中的一些带电基团（尤其是碱性蛋白）发生吸附作用。但一般在离子强度大于0.05的条件下，几乎没有吸附作用。 5、有各种颗粒大小（粗、中、细、超细）可以选择，一般粗颗粒流速快，但分辨率较差；细颗粒流速慢，但分辨率高。 6、机械稳定性相对较差，不耐压，分辨率高的细颗粒要求流速较慢，所以不能实现快速而高效的分离。 47保存保存保存的方法有干法、湿法和半缩法三种。湿法：加入一定量的防腐剂置于冰箱中作短期保存（6个月以内）。常用0.02%叠氮化钠、0.02%三氯叔丁醇、20%乙醇等。干法：用浓度逐渐升高的乙醇分步处理洗净的凝胶，脱水收缩，抽滤，用6080吹干。半

22、缩法：48（二二）修饰葡聚糖凝胶修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex)（一）亲脂性葡聚糖凝胶（Lipophilic Sephadex） 骨架结构上引入一些有机基团，如甲基、羟丙基，使呈亲脂性，同时保留亲水性。 这种凝胶既亲脂又亲水，可在多种有机溶剂中膨胀。这种凝胶在pH2的不含氧化剂的溶液中稳定。用低级醇为溶剂时，对芳香族、杂环族化合物仍有吸附作用。但用氯仿时则可去除对上述化合物的吸附作用，而对含羟基与羧基的化合物却有吸附作用 。 国产国产Sephadex LHSephadex LH2020可用于分子筛层析、吸附层析和可用于分子筛层析、吸附层析和分配层析。很适用于脂肪酸、甘油脂

23、、类固醇、维生素、激分配层析。很适用于脂肪酸、甘油脂、类固醇、维生素、激素类生化产品的分离。洗脱剂可用单一有机溶剂如甲醇、氯素类生化产品的分离。洗脱剂可用单一有机溶剂如甲醇、氯仿等，也可用混合溶剂如氯仿与甲醇的混合液。仿等，也可用混合溶剂如氯仿与甲醇的混合液。（二）葡聚糖凝胶离子交换剂（二）葡聚糖凝胶离子交换剂 在在G G类凝胶上引入一些酸性或碱性基团后，则制得各种葡类凝胶上引入一些酸性或碱性基团后，则制得各种葡聚糖凝胶离子交换剂聚糖凝胶离子交换剂 。 如引入磺乙基（如引入磺乙基（SE-SephadexSE-Sephadex）、羧甲基（）、羧甲基（CM-SephadexCM-Sephadex）

24、及二乙胺基乙基（及二乙胺基乙基（DEAE-Sephadex ADEAE-Sephadex A）等。葡聚糖凝胶离子交）等。葡聚糖凝胶离子交换剂具有离子交换和分子筛双重作用。其结构多孔、疏松、非换剂具有离子交换和分子筛双重作用。其结构多孔、疏松、非特异性吸附很少，层析时流速易控制，特别适用于蛋白质、酶特异性吸附很少，层析时流速易控制，特别适用于蛋白质、酶、激素、多核苷酸等的分离纯化，以及生化制剂的除热原。、激素、多核苷酸等的分离纯化，以及生化制剂的除热原。 51 （三）Supperdex系凝胶由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成。（四）Sephacryl系凝胶是由烯丙烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺

25、共价交联制成的。理化稳定性好，为硬性凝胶，可耐高压灭菌。52Supperdex系凝胶系凝胶53Sephacryl系凝胶系凝胶54（三三) )、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 商品名为生物凝胶-P（Bio-Gel P）。该凝胶由丙烯酰胺组成；以亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，聚合而成。只要控制单体用量和交联剂的比例，就能得到不同型号的凝胶。特点： 1、孔径； 2、稳定性、强度； 3、无非特异吸附，保存方便； 4、编号反映出它的分离界限。 在聚丙烯酰胺凝胶的合成过程中，单体和交联剂的配比在聚丙烯酰胺凝胶的合成过程中，单体和交联剂的配比可以任意改变。以（可以任意改变。以（T T）代表）代表100mL100

26、mL凝胶溶液中含有的单体和凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数，称为交联剂总克数，称为凝胶浓度凝胶浓度。而其中交联剂占单体和交联。而其中交联剂占单体和交联剂总量的百分比称为剂总量的百分比称为交联度交联度，以（，以（C C）表示，交联度越大，网）表示，交联度越大，网孔越小，交联度越小，则网孔越大。聚丙烯酰胺凝胶全是由孔越小，交联度越小，则网孔越大。聚丙烯酰胺凝胶全是由碳一碳骨架构成，稳定性较好，适合于做凝胶层析的载体。碳一碳骨架构成，稳定性较好，适合于做凝胶层析的载体。只有在极端只有在极端pHpH条件下酰胺键才被水解为羧基，使凝胶带有一条件下酰胺键才被水解为羧基，使凝胶带有一定的离子交换基团，故一

27、般只在定的离子交换基团，故一般只在pH2pH21111的范围内使用。的范围内使用。 像像SephadexSephadex一样，商品聚丙烯酰胺为颗粒状的干粉，它一样，商品聚丙烯酰胺为颗粒状的干粉，它有十分明显形成块状并粘附在一起的倾向，在溶剂中能自动有十分明显形成块状并粘附在一起的倾向，在溶剂中能自动溶胀成胶。溶胀成胶。 根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不同，可根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不同，可分成分成1010种类型。各种类型均以英文字母种类型。各种类型均以英文字母P P和阿拉伯数字表示，和阿拉伯数字表示，从从Bio-Gel P-2Bio-Gel P-2至至Bio-Ge1

28、P-300Bio-Ge1 P-300。P P后面的阿拉伯数字乘以后面的阿拉伯数字乘以10001000即相当于排阻限度（按球蛋白或肽计算）。即相当于排阻限度（按球蛋白或肽计算）。目前，美国目前，美国Bio-Rad LaboratoriesBio-Rad Laboratories生产并出售多种规格的生产并出售多种规格的Bio-Gel PBio-Gel P。57聚丙烯酰胺凝胶的性质聚丙烯酰胺凝胶的性质 生物凝胶的编号反映出它的分离界限。如Bio-Gel P-100。58( (四四) )、琼脂糖类凝胶、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ） （一）琼脂糖凝胶结构是由-D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳

29、糖以-1，3-和-1，4-糖苷键相间连接而成的链状分子。SepharoseSepharose 琼脂糖凝胶（agarose gel）可以分离葡聚糖凝胶和生物胶所不能分离的大分子，使凝胶层析的分离区间扩大到大分子和病毒颗粒，其最大范围可达相对分子质量108，但是由于琼脂有强烈的吸附作用，给使用造成了困难，后来，从琼脂中分离出两个组分，一个组分为带负电荷的琼脂果胶，含有磺酸基和羧基；另一组分叫琼脂糖，它不含有带电基团，其结构是有-D-吡喃半乳糖和3，6脱水-L-吡喃半乳糖相结合的链状多糖。这种琼脂糖被用来进行凝胶层析，它既具有琼脂凝胶相同的分离区间，又没有吸附作用。但其稳定性远不如葡聚糖凝胶和生物胶

30、P，强酸强碱能引起结构破坏。最好使用条件控制在pH 49之间，温度040，超出此范围,可能被破坏。61琼脂糖凝胶特点：琼脂糖凝胶特点：1、没有共价键的交联。2、孔径依赖于琼脂糖的浓度。3、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。4、非特异性吸附力低。5、分离范围大。6、颗粒强度差。 琼脂糖的商品名称有: Sepharose(瑞典) Bio-gel A(美国) Segavac(英国) Gelarose(丹麦)等多种，因生产厂家不同名称各异。 琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶。它的商品名因生产厂家不同而异。 瑞典的商品名称为Sepharose，有3种型号，即Sepharose 2B，4B和6B（同中国相

31、同）。阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分含量。 美国的为BioGA，有6个型号，即Bio-G 0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯数字乘以106表示排阻限度。 。 英国的称为Sagavac，又分为Sagavac 2F，4F，6F，8F，10F和2C，4C，6C，8C，10C。前面的阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分数，F代表粉末状，C代表颗粒状。 丹麦的称为Gelarose，有5种类型，即2，4，6%，8和10。 琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水干燥，否则不能再溶胀恢复原有形状，因此商品大都以含水状态供应，并应在湿态保存。一般悬浮在l0-3 mo1/L EDTA和0.02%叠氮化钠溶

32、液中。百分数表示干胶量。66琼脂糖凝胶分离范围琼脂糖凝胶分离范围琼脂糖凝胶有3个规格：Sepharose2B、4B、6B分别表示琼脂糖浓度为2%，4%，6%。67 架桥琼脂糖凝胶为琼脂线性分子经1，3-二溴丙醇交联的凝胶。它的凝胶孔径均匀，机械强度明显加大。对热和化学物质的稳定性大大增加,在pH314范围内稳定。 架桥琼脂糖凝胶（架桥琼脂糖凝胶（Sepharose CL）68Sepharose CL的性质的性质 69超胶（超胶（Utro-gel ACA）所谓超胶是琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶。商品名称后面的编号为两位数，各表示混合胶中聚丙烯酰胺与琼脂糖的百分浓度。70 Superose系凝胶系

33、凝胶 是由珠状琼脂糖经两次交联制得的可用于HPLC的高速凝胶过滤介质。有6%和12%两个规格。71（五五）、多孔玻璃微球、多孔玻璃微球(Bio-glas)特点： 1、化学稳定性高、强度大。 2、对糖类、蛋白质等物质有吸附作用。 3、编号表示其孔径, 越大，分离分子量也越大。72六、疏水性凝胶（六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）常见的有：聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。Styragel商品, 分离范围为1 60040 000 000。生物珠（Bio-Bead S），适于分离分子量较小的物质。分离不溶水的有机物质。73常用的商品化凝胶介质常用的商品化凝胶介质 74一一五、五、 凝

34、胶层析的凝胶层析的生产生产条件和操作条件和操作 7576凝胶层析的凝胶层析的生产生产条件和操作条件和操作 （一）、凝胶的选择（一）、凝胶的选择（二）、凝胶层析柱的设计（二）、凝胶层析柱的设计 （三）、凝胶层析柱的填装（三）、凝胶层析柱的填装（四）、（四）、凝胶床的检查和维护凝胶床的检查和维护（五）、凝胶层析操作（五）、凝胶层析操作 77（一一）凝胶的选择凝胶的选择一、凝胶的选择 选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）还有它的理化稳定性、强度、非特异吸附性质等；另一方面还要注意到分离目的和样品的性质

35、。 凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。般来说，细粒凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐等。下图表示在同一流速下不同粒度的Sephadex G-25柱的洗脱效果。 凝胶粒度与洗脱效果的关系图凝胶粒度与洗脱效果的关系图 对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。另一类则是要将分子量相差不很大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。后者对实验条件和操作要求都比较高。下面以最常用的葡聚糖凝胶类为例，分别加以讨论 。

36、 80将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。将分子量相差不大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。1 1类分离类分离 目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组”和“较小分子组”两类物质，并不要求分离分子量相近的组分。 选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd= 0，小分子的Kd1。这样能取得最好的分离效果。例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知道，蛋白质的分子量都大于5000D，而无机盐的分子量一般在几十到几百之间。所以常选用Sephadex G-25凝胶作为分离固定相，

37、因为它的分离范围是10005000D。被分离的两组物质的分子量正好落在分离范围的两侧。大分子组为全排阻，而小分子组为全渗入，其Kd值的差可达最大值1。对于分子量小于5000D的肽类进行脱盐操作则常选用Sephadex G-15凝胶。83（1）使大分子的分配系数Kd=0；（2）小分子的Kd=1。选用Sephadex G-25凝胶，分离范围1 0005 000。2 2分级分离分级分离 目的是分开分子量不很悬殊的大分子物质。选择凝胶型号时必须使各种物质的Kd值尽可能相差大一些。为此，首先决不能使它们的分子量都分布在凝胶分离范围的一侧，也就是Kd不要都接近于0或1，而要使组分的分子量尽可能分布在凝胶分

38、离范围的两侧，或接近两侧的位置。如果样品中含有3个组分的话，最好一个接近全排阻，另一个接近全渗入，第三个为部分渗入，且分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的13。因为分子量如与渗入限比较靠近，该组分分子在凝胶颗粒中运动所受的约束很小，不易与低分子组分分开。如分子量与排阻限比较靠近则不易与高分子组分分开。如用Sephadex G-200分离血清蛋白质的效果要比Sephadex G-150为好。但也有人选用G-150，那是因为G-200强度太低不便操作的缘故（见下图）。 不同分离范围的葡聚糖凝胶上，血清蛋白的层析图不同分离范围的葡聚糖凝胶上，血清蛋白的层析图87（1）使各种物质的Kd值尽可能相差大

39、。（2）不使分子量分布在凝胶分离范围的一侧。（3）分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的1/3。如用Sephadex G-200分离血清蛋白质的效果要比Sephadex G-150为好。88二、二、凝胶粒度的选择凝胶粒度的选择细粒凝胶柱流速低，洗脱峰窄，分辨率高，用于精制分离或分析。粗粒凝胶柱流速高，洗脱峰平坦，分辨率低，用于粗制分离，脱盐。 凝胶颗粒大小一般分为粗、中、细和超细四类。颗粒越细，分离效果越好，因为它容易达到平衡，但流速慢。颗粒越粗，流速越快，会使区带扩散，使洗脱峰变平变宽。在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70m左右较合适。对于在水中保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150m左右

40、。凝胶颗粒大小要均匀，这样流速稳定，效果较好。 产品名称：琼脂糖凝胶 4FF英文名称：Sepharose 4FF性 状：白色微球, 无嗅、无味凝胶类型：凝胶层析介质；快流速，物理与化学性质稳定。产品基质：4琼脂糖粒 径：45-165m工作PH值：3-13操作温度：4-40 分离范围：70,000-20 106保存条件：4-8应 用：巨大分子，病毒，疫苗的分离纯化等包 装：10升/桶琼脂糖凝胶 4FF，大大加强了机械性能，流速特快，适合工业规模生产。经去电荷处理，非特异性吸附极低，提高回收率。极高的化学稳定性，可用多种促溶剂、有机溶剂工作及0.1-0.5M NaOH 在位清洗 凝胶过滤分离总览凝

41、胶过滤分离总览93 （二二）、凝胶层析柱的设计、凝胶层析柱的设计 1、层析柱2、蠕动泵3、检测仪4、工作站95 1 1、层析柱层析柱层析柱长度与直径的比值称作“柱比”。对于类分离，柱床体积一般为样品溶液体积的5倍，柱比5:1到10:1即可。对于分级分离，则要求柱床体积大于样品体积25倍以上，至多达100倍。柱比在25至100之间。BPG层析柱通用电气公司 （英语：General Electric Company, GE，NYSE：GE）是美国一家提供技术和服务业务的跨国公司。BPGBPG层析柱层析柱BPGBPG层析柱层析柱蠕动泵蠕动泵英国Watson-Marlow公司是斯派莎克集团的下属公司沃

42、森马洛生产。工作原理：通过对泵的弹性输送软管交替进行挤压和释放来泵送流体。检测仪检测仪1、紫外检测仪是液相色谱中的一种紫外装置，仪器配上层析柱，恒流泵，部分收集器等，即组成一完整的液相色谱分离分析装置。2、紫外检测仪波长：280nm和215nm。检测仪检测仪3、仪器工作原理的依据是光吸收定律。从光源发出的光经狭缝、滤光片、样品池到光电培增管上，使束由于样品浓度不同所引起光强的变化转换成光电流的变化，此光电流经放大器输入到对数转换器，使透光率T转成A输出，即A=1g =CL式中为待测样品的克分子消光系统，C为样品浓度，采用克分子/升单位，L为光程，用厘米作单位。根据上式就知测出了A，就知样品浓度

43、C。若从放大器直接输入记录仪，绘出的是样品透光率T变化的图谱，若从对数转换器输入到记录仪绘出的是样品光密度A变化的图谱。检测仪检测仪4、蛋白质分子中所含的酪氨酸和色氨酸残基使蛋白质在下具有最大吸收值。5、CPS在206nm有吸收、一般在外水体积有吸收。 6、蛋白质的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收测定时，可用215nm来测定。工作站工作站从紫外检测仪对数转换器输入到记录仪（电脑）绘出样品光密度A变化的图谱。工作站工作站mAU是任意毫吸光度，一般仪器自带的工作站处理软件都倾向于使用这个单位，而mV则是仪器后方有块数据传出板，如果使用其他的工作站软件，需要从这块板子上引出两根数据线，通过数据线传递的电信号转化成数字信号，这也就色谱图上纵坐标mV的来源。AU= 吸光度单位 = Absorbance Uint1AU=1000mv=1V1AU=1000mv工作站工作站106（三三）凝胶）凝胶层析柱层析柱的装填的装填1、凝胶的预处理2、凝胶填装3、不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶分层和胶面倾