实验六放线菌素D诱导细胞凋亡形态学观察

1、实验六、细胞凋亡的诱导及观察实验六、细胞凋亡的诱导及观察2002年10月7日，瑞典卡罗林斯卡医学院诺贝尔奖评审委员会将2002年诺贝尔生理学或医学奖授予了悉尼布雷内、罗伯特霍维茨和约翰苏尔斯顿三位科学家，以表彰他们在“细胞程序性死亡”这一领域中的开创性工作。他们不但发现在生物的器官发育过程中存在细胞程序性死亡，而且阐明了细胞程序性死亡过程中的基因规律。 实验目的实验目的 1.了解细胞凋亡的原理了解细胞凋亡的原理 2.学习离体诱导细胞凋亡的方法学习离体诱导细胞凋亡的方法 2.掌握利用普通显微镜和荧光显微镜掌握利用普通显微镜和荧光显微镜观察凋亡细胞形态的方法观察凋亡细胞形态的方法一、细胞死亡（一、

2、细胞死亡（cell death）定义：定义： 细胞生命现象不可逆的停止，分为两种细胞生命现象不可逆的停止，分为两种形式，即形式，即坏死性死亡坏死性死亡和和程序性死亡程序性死亡。1. 坏死性死亡坏死性死亡（necrosis）定义：定义： 细胞外部的化学、物理或者生物的细胞外部的化学、物理或者生物的因素的侵袭而造成的细胞崩溃和裂解，因素的侵袭而造成的细胞崩溃和裂解，是被动的死亡。是被动的死亡。2.程序性死亡程序性死亡（programmed cell death, pcd）定义定义：细胞在一定的生理或者病理条件下按照自身细胞在一定的生理或者病理条件下按照自身的程序结束其生存，是细胞接受指令后进的程序

3、结束其生存，是细胞接受指令后进行的主动性死亡，涉及一系列基因的激活、行的主动性死亡，涉及一系列基因的激活、表达和调控。受内在遗传机制的控制主动表达和调控。受内在遗传机制的控制主动结束生命的过程。结束生命的过程。程序性死亡主要包括细胞凋亡（程序性死亡主要包括细胞凋亡（apoptosisapoptosis）和细胞自噬（和细胞自噬（autophageautophage) ) ，2.1 细胞凋亡（细胞凋亡（apoptosis）定义：定义：是由体内外因素触发细胞内预存是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞主动死亡过程的死亡程序而导致的细胞主动死亡过程. .凋亡细胞将被邻近的细胞或吞噬细胞所凋

4、亡细胞将被邻近的细胞或吞噬细胞所吞噬并消化吞噬并消化2.2 细胞凋亡诱导因素细胞凋亡诱导因素 内源性因素；内源性的因素包括细胞凋内源性因素；内源性的因素包括细胞凋亡诱发机制（如亡诱发机制（如asas配体、肿瘤坏死因配体、肿瘤坏死因子等）的激活和抑制机制（生长因子、子等）的激活和抑制机制（生长因子、激素、受体因子等增殖性因子）的失活。激素、受体因子等增殖性因子）的失活。 外源性的因素；外源性的因素包括放射外源性的因素；外源性的因素包括放射线、热休克等物理性因素，药物、毒物线、热休克等物理性因素，药物、毒物等化学性因素以及病毒、细菌等生物学等化学性因素以及病毒、细菌等生物学因素。因素。 2.3 细

5、胞凋亡的生物学特征细胞凋亡的生物学特征 形态学特征形态学特征 生物化学特征生物化学特征 dnadna片段化片段化 大分子的合成大分子的合成 ttgttg（组织转谷氨酰胺酶）的积累组织转谷氨酰胺酶）的积累并达到较高的水平。并达到较高的水平。 形态学特征 细胞变圆、胞质皱缩，细胞体积减小，细胞变圆、胞质皱缩，细胞体积减小，染色质凝聚，核碎裂成为染色质块（核染色质凝聚，核碎裂成为染色质块（核碎片）碎片） 。整个细胞通过发芽、起泡等方。整个细胞通过发芽、起泡等方式产生一些球形突起，并在基部脱落形式产生一些球形突起，并在基部脱落形成大小不等的、内含胞质、细胞器和核成大小不等的、内含胞质、细胞器和核碎片的

6、凋亡小体（碎片的凋亡小体（apoptotic body）。）。 凋亡的起始：凋亡的起始： 细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，细胞表面的特化结构如微绒毛消失，细胞间接触的消失，但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内但细胞膜依然完整；线粒体大体完整，但核糖体逐渐从内质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质网上脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布质固缩，形成新月形帽状结构等形态，沿着核膜分布 凋亡小体的形成凋亡小体的形成: : 核染色质断裂为大小不等的片段，与某些细胞器如线粒体核染色质断裂为大小不等的片段，

7、与某些细胞器如线粒体一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许一起聚集，为反折的细胞质膜所包围。细胞表面产生了许多泡状或芽状突起，逐渐形成单个的凋亡小体多泡状或芽状突起，逐渐形成单个的凋亡小体凋亡小体逐渐为邻近的细胞或吞噬细胞所吞噬并消化。凋亡小体逐渐为邻近的细胞或吞噬细胞所吞噬并消化。细胞凋亡过程的3个阶段坏死坏死凋亡凋亡形态学特征膜完整性丧失胞浆和线粒体膨胀 全细胞裂解 胞膜出芽，但保持完整染色体聚集在核膜周边胞浆收缩、细胞核凝集最后细胞分裂为凋亡小体bcl-2家族蛋白导致线粒体膜通透性增加生化特征离子内环境失调非能量依赖性的（被动过程，在4c也可以发生）随机消化dna（电泳显示为

8、dna弥散状态）postlytic dna断裂 atp依赖性的（主动过程，在4c不能发生）以核小体为单位剪切dna（电泳显示为dna ladder）prelytic dna 断裂线粒体释放多种因子至胞浆中（细胞色素c、aif）caspases级联活化膜对称性改变（ps外翻）生理学特征影响群组细胞 由非生理学因素引起（如补体攻击、代谢中毒、缺氧等）被巨噬细胞吞噬 周围有明显的炎症反应只影响单个细胞 由生理学刺激诱导（如生长因子缺乏、激素环境改变等）被临近细胞和巨噬细胞吞噬 无炎症反应细胞的两种死亡方式及比较 细胞凋亡的形态学检测细胞凋亡的形态学检测1 1 光学显微镜和倒置显微镜光学显微镜和倒置显

9、微镜 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。2 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的dna特异性染料有：ho ,hoechst 33342;ho, hoechst 33258; dapi；吖啶橙。3 3 电子显微镜观察电子显微镜观察dapi 4，6-联脒联脒-2-苯基吲哚苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole ) 可以穿透

10、活细胞膜，对活细胞可以穿透活细胞膜，对活细胞无毒无毒副作用副作用 与双链与双链dna结合产生比结合产生比dapi自身强自身强20多倍的荧多倍的荧光光 与单链与单链dna结合后，荧光不增强结合后，荧光不增强 ex 340 nm; em 488 nm (nur dapi) ex 364 nm; em 454 nm (dapi-dna-complex) （蓝光）（蓝光） 优点：结合力强，荧光强且稳定优点：结合力强，荧光强且稳定 缺点：自身有荧光，背景高。致癌缺点：自身有荧光，背景高。致癌nuclear morphological changes of hela cells in apoptosis

11、process by using dapihoechst hoechst是一种水溶性双苯咪唑类化合物， 可以穿透活细胞膜， hoechst 33342比hoechst 33258更易穿透活细胞膜，对活细胞的毒性较低 与dna结合后荧光明显增强 ex 346nm; em 460 nm (33258) ex 350 nm; em 461 nm (hoechst -dna-complex) （蓝光） 在凋亡细胞中，细胞膜对hoechst 33258的摄取增高，并且由于染色体高度浓缩，染色呈强蓝色荧光 优点：结合力强，荧光强于dapi，缺点：自身有荧光，背景高。稳定性比dapi差， 致癌结 果正常细胞

12、核正常细胞核有致密浓染的 凋亡细胞核吖啶橙 3,6-bis(dimethylamino)acridine 3,6-bis(dimethylamino)acridine hydrochloridehydrochloride 吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，对细胞中的吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，对细胞中的dnadna和和rnarna同时染色而显示不同颜色的荧光，同时染色而显示不同颜色的荧光，dnadna呈呈绿色荧光，绿色荧光，rnarna呈橙红色荧光。呈橙红色荧光。 细胞核因含细胞核因含dnadna呈绿色，细胞质及核仁因含呈绿色，细胞质及核仁因含rnarna呈呈红色；红色； exex 495

13、nm; 495 nm; emem 526 nm in te buffer ph 526 nm in te buffer ph 8.0 8.0 emem 526 nm with dna, 526 nm with dna, emem 650 nm with dna 650 nm with dna (enhanced fluorescence with dna(enhanced fluorescence with dna）, , 优点：结合力强，稳定优点：结合力强，稳定 缺点：自身有荧光，背景高。缺点：自身有荧光，背景高。 电镜观察电镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩

14、。凋亡亡期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构。细胞凋亡的晚期，细胞为气穴现象的空泡结构。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块。核裂解为碎块。 t细胞杂交瘤细胞 (扫描电镜) 内源性核酸内切内源性核酸内切酶基因的活化和表酶基因的活化和表达，导致凋亡细胞达，导致凋亡细胞的染色质的染色质dna的有的有控裂解，得到的控裂解，得到的dna片段的长度为片段的长度为180-200bp的倍数。的倍数。生化特征：生化特征：dna梯状条带梯状条带细胞色素细胞色素c诱导的凋亡细胞诱导的凋亡细胞dna电泳图电泳图1细胞色素细胞色素c诱导诱导0 h2细胞色素细胞色

15、素c诱导诱导1 h3细胞色素细胞色素c诱导诱导2 h4细胞色素细胞色素c诱导诱导3 h5细胞色素细胞色素c诱导诱导4 h6阴性对照阴性对照7marker （ 自赵允、翟中和）自赵允、翟中和）最简便可靠的方法最简便可靠的方法2.4 细胞凋亡的意义细胞凋亡的意义 1.1.动物机体靠对细胞增殖和细胞周期的动物机体靠对细胞增殖和细胞周期的正负控制以及对细胞凋亡的正负控制来正负控制以及对细胞凋亡的正负控制来维持细胞总数的平衡和机体的生命活力。维持细胞总数的平衡和机体的生命活力。 如：如：健康的成人体内，在骨髓和肠中，健康的成人体内，在骨髓和肠中，每小时约有每小时约有10亿个细胞凋亡。亿个细胞凋亡。 2.

16、 2. 细胞凋亡在形态建成中起到重要作用细胞凋亡在形态建成中起到重要作用（如手指和脚趾的发育），或者对于不（如手指和脚趾的发育），或者对于不再需要的构造加以消除（如蝌蚪尾巴的再需要的构造加以消除（如蝌蚪尾巴的消除）。消除）。 3.细胞凋亡还能够调节细胞的数量和质量。细胞凋亡还能够调节细胞的数量和质量。细胞凋亡对发育中细胞凋亡对发育中 神经细胞数量的调节神经细胞数量的调节 4.细胞凋亡的研究加深人们对生命现象及某些疾病的认识实验六实验六、细胞凋亡的观察、细胞凋亡的观察 原理：hela细胞经放线菌素d诱导后，可以产生不同程度的细胞凋亡，利用荧光染色，可以观察到典型的凋亡核（核碎片）。凋亡核呈颗粒团

17、状分布，颜色较正常细胞致密且浓染。材料及设备：材料及设备：hela贴壁培养细胞、贴壁培养细胞、250 mg/ml 放线菌素放线菌素d（actinomycin d）、）、吖啶橙荧光染料、吖啶橙荧光染料、卡诺氏固定液、卡诺氏固定液、0.9%生理盐水、生理盐水、10%甘甘油油荧光显微镜、盖玻片、载玻片、镊子、一荧光显微镜、盖玻片、载玻片、镊子、一次性吸管、离心机、次性吸管、离心机、ep管、培养皿、小管、培养皿、小烧杯等。烧杯等。实验步骤实验步骤 1.1.诱导：诱导： 向处于对数生长期的向处于对数生长期的hela细胞中加入细胞中加入250mg/ml的放的放线菌素线菌素d溶液溶液1015l（终浓度（终浓

18、度0.50.75ug/ml），），继续继续培养培养18 h左右；左右； 2.2.细胞收集和洗涤：细胞收集和洗涤： 将细胞悬液平均转移到将细胞悬液平均转移到4个个1.5毫升的毫升的ep管中，用管中，用1ml生理盐水清洗细胞生理盐水清洗细胞,去掉生理盐水去掉生理盐水,将瓶壁上剩余细将瓶壁上剩余细胞用胞用1ml 0.25%的胰酶消化的胰酶消化3min后，将细胞悬液加入后，将细胞悬液加入培养皿培养皿,吹打生长面吹打生长面, 平均合并至平均合并至4个个ep管中。以管中。以2000rpm离心离心 6-8min，去上清；去上清； 3.3.细胞预固定和固定：细胞预固定和固定： 加入加入0.9毫升生理盐水，悬浮细胞，毫升生理盐水，悬浮细胞，使细胞分散，使细胞分散，加入加入0.1毫升卡诺氏固定毫升卡诺氏固定液液，混匀；离心，去上清（保留，混匀；离心，去上清（保留0.