溶菌酶检验标准

1、1术语和定义溶菌酶酶活性单位：在25C、pH值为6.2的条件下，于450nm处每分钟引起溶酶小球 菌体（Micrococcus Lysodeiktidus ）溶液吸光度下降0.001所需要的酶量为一个酶活性单 位UL本定义适合“比浊法”。溶菌酶效价：溶菌酶在一定浓度范围内，其对数计量与抑菌圈直径（面积）呈对数关系, 通过检测其对微生物的抑制作用，比较标准品与样品产生抑菌圈的大小，计算出样品的效价, 单位为u。本定义适合“管碟法”。2技术要求2.1外观和性状要求粉酶为白色或微黄色的结晶或无定形粉末。2.2技术指标4.2.1 粉酶水分含量：w 12%4.2.2 粉酶粒度：420卩m孔径分析筛筛上物

2、w 4%4.2.3 粉酶炽灼残渣：w 10.0%。4.2.4 酶活（效价）指标表1产品成分分析保证值项目指标粉状50型溶菌酶酶活性（效价），U/g （u）5000004.2.5 卫生指标符合GB 13078和NY/T 722的有关规定 3试验方法本标准所用试剂和水，在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和 GB/T 6682中规定的 三级水，所用试液中的标准溶液，在没有注明其他要求时均要求按GB/T 601，GB/T 602制备。3.1外观的测定取样品少许放入烧杯，下衬白纸进行目测。3.2粉酶水分的测定按GB/T 6435规定进行检测。3.3粉酶粒度的测定按GB/T 5917规定进行检测。3.4

3、粉酶炽灼残渣的测定按中国兽药典规定进行检测。3.5 卫生指标的测定按饲料卫生标准GB13078和NY/T 722规定的方法进行。3.6 溶菌酶酶活性 （效价） 的测定 溶菌酶微生物测定法系在适宜条件下， 通过检测溶菌酶对微生物的抑制作用， 计算出溶 菌酶活性（效价）的方法。依据试验设计原理不同， 可分为比浊法和琼脂扩散法 （即管碟法）。3.6.1 试剂和溶液5.6.1.1 溶酶小球菌（ Micrococcus Lysodeiktidus ）将溶酶小球菌接种于固体培养基上，置37E培养48小时，用无菌水将菌体洗下，用纱布滤过，滤液离心后，倾去上层清液，用水洗涤菌体数次，然后用少量水悬浮，冰冻干燥

4、， 得淡黄色粉末，供测定用，保存一年。使用时，在营养琼脂斜面上活化，传代培养，工作用菌种不超过 5 代，斜面菌种从培养 好到使用时间，最长不超过2个月。并将培养好的斜面菌种，放置 4°C冰箱保存。制备的菌 悬液可以使用一周，不用时放置 4C冰箱保存。5.6.1.2 磷酸缓冲液称取磷酸二氢钠（NaHPO.2H2O） 11.7g,磷酸氢二钠（NOHPQ12H2O 7.86g，力卩 900mL 水溶解,调pH值至6.2，定容至1000mL5.6.1.3 10氢氧化钠溶液5.6.1.4 1硫酸铜溶液5.6.1.5 30%三氯醋酸5.6.1.6 斜面培 养基： 营养琼脂5.6.1.7 抗生素检

5、定培 养基 II 号5.6.1.8 溶菌酶标准品3.6.2 仪器5.6.2.1分析天平：精密度 0.1mg；562.2 牛津杯：牛津杯内径 6.0 ± 0.1mm 外径7.8 ± 0.1mm 高10.0 ± 0.1mm 每套牛 津杯的重量差异不超过± 0.05g ，内外壁及两端面光滑平坦。管壁厚薄一致；5.6.2.3 陶瓦盖：内径约103mm外径108mm平坦，吸水性强。应定期清洗、干燥或干 热灭菌；5.6.2.4 游标卡尺：精度 0.02mm；5.6.2.5 双碟：内径约90mm外径16mrrr 17mn!勺硬质玻璃或塑料培养平皿，碟底厚薄均 匀，水平

6、透明，无色斑气泡；5.6.2.6 超净工作台：有效工作面局部洁净度 100 级。用于试验菌的接种传代或菌悬液 制备；5.6.2.7 pH酸度计：精确至V 0.01 ;5.6.2.8 分光光度计：配10mni：匕色皿，可在450nm下测定吸光值；5.6.2.9 离心机：转速为 4000r/min 以上；562.10 秒表：每小时误差不超过 5s；562.11 恒温培养箱：设置漂移温度为 35C37C；5.6.2.12 高压灭菌锅5.6.2.13 烘箱5.6.2.14 其它玻璃器皿：刻度吸管：1 mL , 2mL, 5mL, 10mL, 25mL无菌吸管等；3.6.3试验方法5.6.3.1 鉴别固

7、体样品：取本品10mg溶于1mL水中，加30汇氯醋酸2滴，产生白色沉淀。取试管一支，加5%§菌酶水溶液2滴、103氢氧化钠5滴及19硫酸铜溶液1滴，混匀后, 应显紫玫瑰色。5.6.3.2方法一：比浊法特定浓度的溶酶小球菌悬浮液在 450nm条件下存在一定吸光度，溶酶菌作用于溶酶小球 菌底物会引起吸光度降低，通过计算指定时间内吸光度降低的幅度可以计算出溶菌酶的活 力。 试验步骤：精确称取样品（液体样品需在离心机上以3500r/min离心10min后取上清液）不少于20mg用pH6.2的0.1mol/L磷酸缓冲液稀释到酶活单位为 100U/ mL 200U/mL,备用。将保存好的溶酶小球

8、菌在营养琼脂斜面上活化，传代两次后的菌体37C培养48小时，再用生理盐水从培养基上洗脱下来，并稀释到一定倍数，使其在25C时，在450nm波长处测定的吸光度A为0.650.75之间。精密取底物悬浮液2.5mL，放入比色杯中，在450nm波长处测定其吸光度，作为零时读 数，然后取样品溶液0.5mL,加入比色杯中，用秒表开始计时，迅速混合，以磷酸缓冲液做 空白，至V 60秒时记下吸光度 A。、。 试样酶活力的计算：1000Xd =X （A 0-A60） X NX 2（1）M式（1）中：Xd待测样品的溶困酶活力，U/g （或mL）A0秒时的吸光度Aso60秒时的吸光度M样品质量，g （或ml） LN

9、 样品总的稀释倍数5.6.3.3 方法二：管碟法利用溶菌酶的抗菌性质及 其溶液 在琼脂培养基内的扩散作用， 将未知效价的样品液与已 知效价的标准溶液， 在同一条件下， 在摊布高度敏感性特定试验菌的培养基上 进行一定时间 的对照培养 ，溶菌酶 溶液在培养基内的扩散到达适当范围内 时就产生了抑制试验菌生长的透 明抑菌圈， 并且在一定的溶菌酶浓度范围内，溶菌酶对数浓度与抑菌圈直径成正比。 经比较 标准液与样品两者抑菌圈直径或面积大小，采用二剂量法，即可推算出样品的效价。 菌悬液的制备：将保存好的溶酶小球菌在营养琼脂斜面上活化，传代两次后的菌体37C培养48小时，再用10mL生理盐水将一支培养好的溶酶

10、小球菌斜面菌体洗下制成菌悬液，尽量保证每次所 加指示菌的浓度一样，供测定用。 测定平板的制备：底层：用灭菌破口移液管（25mL），吸取已融化的培养基20mL注入双碟内，等凝固后更换 干燥的陶瓦盖。菌层：取出溶酶小球菌菌悬液，按 1%的菌量添加，吸取菌悬液加入已融化 冷却至50C55C的培养基内，摇匀作为菌层用。用灭菌 10mL破口移液管，吸取菌层培养 基5mL使均匀分布在底层培养基上，置水平台上，用陶瓦盖覆盖，放置 40min,待凝固， 备用。 待测酶液的准备：精确称取样品（液体样品需在离心机上以 3500r/min 离心 10min 后取上清液）不少于20mg用pH6.2的0.1mol/L磷

11、酸缓冲液稀释到酶活单位在 5000U/mL左右，备用。 标准品、样品的滴加：取8个双碟，在每个双碟中对称放入4个牛津杯，分别成对角滴加标准品高（SH）、标 准品低（SL）及样品高（TH）、样品低（TL）两种浓度的溶液，直至牛津杯口平满。注意滴加溶 液间隔不可过长，因溶液的扩散时间对测定结果有影响。 （注意：标准品必须现配现用，不 能隔夜。从测定平板的制备到进入培养箱培养，整个过程必须在 2小时内完成）。 双碟的培养及抑菌圈的测量将双碟置于37± 0.5 C培养箱中，培养16小时18小时后，取出双碟，测定抑菌圈直 径（如有破圈或不完整的抑菌圈，则应舍弃该碟） 。样品的高低剂量透明圈直径

12、尽量和标准 品的高低剂量透明圈直径接近，整个系统的透明圈直径控制在 15m19mn之间。 结果判定：微生物测定结果的正确性和精密度受很多因素影响， 为了使测定结果更能真实的反映客 观情况，符合设计原理，就必须将测定结果按生物检定统计，进行可靠性测验及效价计算和 可信限计算。统计学分析按药典附录的生物检定统计法进行 F 的显着性测验， 要求直线回归和剂间要 非常显着（P<0.01），偏离平行不应显着（P>0.05）;且可信限率不得超过5%。实验结果在可靠性成立前提下， 方可根据设计的计算公式进行样品效价计算。 将样品的 估计效价控制在实际效价的 90%110%，否则，需要重新估计效价进行测定。(3)式中:R=|°g 丄 T2Ti-SlT2S2 -T1 -S11Pt = R XAt100%(2)R :供试品效价（相当于标