翻译日本锦鲤感染嗜水气单胞菌引起的相关病毒血症的组织病理学观察

1、日本锦鲤感染嗜水气单胞菌引起的相关病毒血症的组织病理学观察摘要：嗜水气单胞菌感染引发相关ANA-AKI-BYO病毒血症是目前在日本锦鲤有高度传染性的一种疾病。当前的研究，是为了确定电晕状病毒和A之间的相互关系。我们通过患病鲤鱼与正常鲤鱼之间的自然同居进行细菌的人为传染实验发现正常鲤鱼皮肤已被轻微受损。实验成功表现出电晕状病毒病毒血症和A的联合作用。在嗜水气单胞菌的感染中。患病的鲤鱼表现出规模囊性水肿，腹水及眼球突出，皮肤形成溃疡等症状。另外还有由于电晕状病毒和A引起感染的病理变化。发生嗜水气单胞菌感染后，全身水肿的皮肤表现出表皮分离，扩大规模液囊，以及真皮水肿并伴有出血和坏死。底层横纹肌水肿且

2、肌肉纤维发生明显萎缩。肝细胞发生萎缩或肿胀呈颗粒状。肾小管细胞呈空泡变性，混浊肿胀，坏死和损伤。在脾和造血组织的巨噬细胞以及肝细胞中发生铁血黄素沉积。因为细菌细胞不直接侵入这些受影响的组织，所以这些变化可能受细菌毒素诱导。 关键词：病毒血症 科罗纳类病毒 嗜水气单胞菌 鲤鱼 皮肤溃疡 全身水肿 肾病简介 据最近报道，一种新的病毒病，viremia - associated ANA-AKI-BYO，在日本锦鲤中普遍流行（宫崎等，2000）。我们确定首次患电晕状病毒（CLV）血症的患病鲤鱼是受到水传播的二次细菌入侵，导致皮肤溃疡的形成。且CLV对鲤鱼本身是致死的。 1999年，通过长期观察发现患病

3、鲤鱼出现规模囊水肿，眼球突出，腹水以及皮肤溃疡等症状。另外可以从病变真皮和内脏器官分离的CLV，从水肿鳞片囊，溃疡性病变和腹水中分离嗜水气单胞菌。病毒血症CLV与嗜水气单胞菌联合感染并不令人意外，因为它之前已被大众所知。虽然病毒和细菌，以及其病理特征之间的相互关系尚未完全确定，但众所周知，患病鲤鱼患有“鲤春病毒血症”（Rhab- dovirus鲤鱼感染，Fijan等1971）常常是因为感染嗜水气单胞菌。而复感染被称为“传染性水肿'（Fijan1972）。 在本研究中，这种复杂的疾病被发现在饲养有高度传染性鲤鱼群的池塘中。因此，我们进行感染实验以确定病毒和细菌是如何被同居的自然患病鲤鱼传

4、染给皮肤已经轻微受损的健康鲤鱼。结果发现，合并感染成功实现。并通过电子显微镜检查病鱼组织，观察其复杂的病理特征来确定疾病与CLV和嗜水气单胞菌之间的相互关系。 材料与方法患病的鲤鱼和鲫鱼的健康：患病鲤鱼（3岁龄，200300克），；来至于饲养在1999年6月和七月之间的寒春的鱼群中，通常表现为水肿但不发生皮肤溃烂。在六月收集五条病鱼进行组织病理学检查和病毒和细菌分离。七月，从同一组的鱼中再次收集16条病鱼作为供体进行感染实验。为实验从池塘中挑选未感染“viremia-associated ana-aki-byo”病毒的健康鲤鱼（2至4岁龄）。这些鱼立即以50ppm的福尔马林溶液浸泡24小时以除

5、去皮肤和鳃上的寄生物。感染实验：每两只皮肤溃疡且自然患病的鲤鱼被安置在6个养鱼池（30L 20）中通气，而剩下的病鱼被放养在水箱中（300 L 20）。 在实验期间，当病鱼在养鱼池中死亡，需要从另备份组中选取另一条病鱼替换。同居前，去除掉几个身体受到轻度损伤的健康鲤鱼（2年生，40至70g）。在每一个养鱼池中，3或四只健康鱼与两条病鱼进行共同饲养。当实验鱼变得奄奄一息，立即清除它们，并更换新的实验鱼。这个实验中，在30 天20°C环境下，.共有30条实验鱼经历了同居实验。作为对照，6例健康鱼（2岁，50克）的皮肤已经损伤，以同样的方式作为实验鱼的健康鲤鱼（3岁，类似于自然病

6、鱼的大小）也出现相同症状。病毒和细菌的分离：根据宫崎等人的说法，CLV病毒是从天然病鱼和实验病鱼中分离出来的 （2000）。从溃疡性病变皮肤，水肿鳞片囊，腹水和肾中分离的细菌，在心脏浸液琼脂平皿上20下进行3天培养。对于大多数从水肿鳞片囊，腹水和肾脏的样品，采用API20测试生长在琼脂平板上单一类型的细菌是否是嗜水气单胞菌。这种细菌表现出对绵羊血琼脂平板上溶血活性。这显示出突出的均裂一些菌落选择人工感染。人工感染嗜水气单胞菌：CLV的致病性在我们以前的研究（宫崎等，2000）有所描述。我们对分离的嗜水气单的致病性进行了检测。生物体在20下培养在心脏浸液肉汤（HI肉汤）48小时。离心培养物以30

7、00×g的速度离心15分钟，使细胞悬浮在盐水上。向10条鲤鱼进行皮下注射菌悬液（0.5毫升），剂量为7.8×104.0 CFU ml-1。为对照，将5条鲤鱼注射相同量的无菌盐水。如后面所指出的，在HI肉汤培养所述细菌并不致病。我们试图在Luria-BERTANI肉汤（LB肉汤用于培养大肠杆菌;细菌蛋白胨10克，酵母提取物5g，氯化钠5克，水1000ml）中培养细菌，其中补充有从健康鲤鱼（4年生2公斤）中提取的5鲤鱼血清。因为嗜水气单胞菌经常被发现在患病金鱼鲫鱼（Kubota等.1981），鲫鱼内（Miyazaki & Kaige ，1986年）和日本鳗鲡鳗鲡（Egu

8、sa 1978, Miyazaki 1980, Kubota 等. 1981），以及健康鱼（Sorimachi & Egusa 1971, Aoki 1974, 1975, Kanai 等. 1977)的消化肠道中，所以选择使用LB培养基。因此，在该方面，嗜水气单胞菌类似于大肠杆菌。此外，嗜水气单胞菌出现在患病鲤鱼的鳞片囊和腹水中。因此，我们选用LB培养基为基础液，用鲤鱼血清补充它。细菌在20下可以良好生长在该培养基中48小时。再次制备细菌悬浮液，5条鲤鱼注入2.6×10 5.0 CFU毫升-1或1 ml的剂量于皮肤下，在6条鲤鱼腹部空腔内注射同样剂量0.5ml 5.2

9、15;10 5.0 CFU毫升-1的菌悬液。建立两个对照组，每一个类型的注射，5鱼注射等量的无菌生理盐水并在20°C下的养鱼池中.喂养观察了30天，然后取样进行组织病理学检查。没有注射的鱼观测其死亡期。病理组织学和电子显微镜检查：用1.5氨基甲酸乙酯溶液进行麻醉，对外部采样后再进行内部解剖和观察。用于组织学观察的病变真皮和内脏器官的组织固定在10磷酸盐缓冲的福尔马林溶液中。根据标准技术制备苏木精 - 伊红（HE），阿赞，吉姆萨（对于细菌），柏林蓝（对于含铁血黄素）和高碘酸希夫（PAS）用于固定组织的生化反应。根据电子显微镜（EM）标准技术将剩余的病变真皮，心脏，脾和肾的组织用70的K

10、arnovsky和1OSO4的溶液处理并固定。 结论 病鱼的自然爆发 自然患病鲤鱼出现松果样外观（规模囊性水肿）肿胀并伴随着皮内出血及毛细血管扩张，眼球突出和腹部腹水膨胀另外还形成了皮肤溃疡（图1A）。皮肤溃疡发生后的10到14天，病鱼逐渐发展上述水肿变化且活着。腹腔内包含有清晰血性腹水。肝，脾，肾和鳃表色苍白。在一些鱼中，肠和脾出血，横纹肌有明显水肿，并含有浑浊或发白肌纤维。在所有的病鱼中，可以从规模囊水肿和腹水和A.中分离出嗜水气单胞菌进行纯培养。从病变的溃疡皮肤中将嗜水气单胞菌与其他细菌进行分离。我们可以成功的从溃疡性皮肤，脾，肾和心脏中分离出宫崎等人（2000）所说的能导致相同的细胞病

11、变效应的那种病毒。图.1.鲤鱼 （A）自然患病鲤鱼吻部，和鳃盖尾鳍显示溃疡性病变，且有规模囊水肿，内皮出血，腹水及眼球突出。（B）患病实验用鲤鱼与同居自然病鱼：这种鱼表现在对一个受伤的部位的身体发生皮肤溃疡伴且随着出血和水肿规模囊。 溃疡性病变损失的组织病理学症状大多与“viremia-associated ANA-AKI-BYO'相同（Miyazaki等人，2000）。然而，在一些区域显示水肿规模囊和皮内出血，且水肿规模囊不断扩大，表皮脱落，真皮疏松结缔中组织规模囊周围，出血，坏死纤维细胞，裂解红细胞和扩张毛细血管上层有纤维蛋白的沉积。底层真皮致密结缔组织也出现水肿。皮下脂肪组织有明

12、显的出血和炎性细胞的浸润。横向肌肉有明显的水肿和出血，肌肉纤维是广泛萎缩且变得破碎（图2A）。虽然细菌是从水肿规模型囊分离的，但是姬姆萨染色结果显示，细菌细胞在这些病变没有显著倍增。在电镜观察下，皮肤损伤处中毛细血管内皮细胞（图2B）和纤维细胞（图2D）中显示的许多CLV颗粒伴随着形成电子致密夹杂物，但在细胞质中没有狭窄管状结构。此外，许多坏死毛细血中的血管内皮细胞呈现细胞核退化，线粒体退化现象，基底膜很多小块状物质且边界不清。因此，毛细管被部分损坏，并允许红细胞从毛细血管（图2C）泄漏。受毛细血管影响的周边胶原纤维发生水肿分离并呈边界不清带型。底层的横向肌肉包含许多肌纤维呈现出碎片化的肌原纤

13、维，线粒体退化和内质网扩大。 在心脏的心室和心房，心脏肌纤维含有支离破碎的肌原纤维发生空泡变性，或包含凝结肌原纤维存在萎缩心肌的内层。在心肌的外层，出血有时发生在受损的肌肉纤维（图3A）。红细胞的小血块形成在管腔心内膜上。在一些鱼中，管腔包含了很多来源于红细胞裂解的细胞核。心外膜表现出血和周围扩张血管炎性细胞渗透。然而，没有证据表明，在坏死性病变心脏内有任何增殖活跃的细菌细胞。电子显微镜下的心肌纤维，通常受影响的纤维具有零散肌原纤维束，许多线粒体退化，而且几乎没有糖原颗粒（图3B）。这一批肌纤维均显着零散和紊乱，或者是裂解伴有肿胀带状。退化线粒体显示2种不同类型损坏的：要么扩大要么凝固。扩大线

14、粒体通常显示为圆形，嵴损坏且无规则。在凝结的线粒体中，嵴大部分消失了，取而代之用非晶体物质。二价阳离子的许多基质的电子致密颗粒会沉积在这些损伤的线粒体。空泡肌纤维具有很多空的空间，在肌浆中有扩展流畅的内质网（SER）和小数目CLV颗粒，而萎缩的肌肉纤维的肌浆中的CLV粒子通常很难观察到.图.2. 鲤鱼在自然爆发。（A-D）水肿病变皮肤。（A）皮肤水肿病变。表皮被分离。底层真皮疏松结缔组织是高度水肿，并伴随着轻微的出血。出血性皮损好发于皮下的脂肪组织和肌肉外侧。 HE。比例尺=200微米。（B）真皮毛细血管的内皮细胞的电子显微镜照片，出现许多电晕状病毒（CLV）颗粒（箭头）并伴随着电子致密物质的

15、生成的夹杂结晶。基底膜难以界定。=1微米。 （C）真皮毛细血管的电子显微照片展现具有坏死内皮细胞和未清除的基底膜。毛细血管（箭头）被部分损坏，并允许红细胞漏出。比例尺= 2.5微米。（D）一种皮肤纤维细胞的电子显微照片。许多CLV颗粒（箭头）和电子致密材料出现在细胞质中。比例尺=2m的。 B：基底膜; C：胶原纤维; D：真皮致密结缔组织; E：红细胞; G：粒细胞; H：出血;I：含结晶夹杂电子致密材料; L：真皮疏松结缔组织; M：横向肌肉 在肝脏中，肝细胞萎缩或肿胀且呈粒状外形（图3C）。有少数肝细胞呈现含铁血黄素沉积颗粒和含铁血黄素巨噬细胞的血窦。该含铁血黄素颗粒柏林蓝染色后

16、为深蓝色。在电子显微镜观察下的混浊肿胀肝细胞，其扩大核边际显示有染色质沉积，嵴破坏的线粒体明显扩大，支离破碎，粗面内质网增大（RER），没有糖原颗粒，且电子透亮细胞质中无CLV颗粒（图3D）。一些膨胀RER包含电子致密物质。萎缩肝细胞具有少量凝结的线粒体，许多零散的RER，含铁血黄素的夹杂物具有高电子密度的细颗粒和无糖原颗粒。脾中许多坏死细胞在浆和护套组织发生纤维蛋白沉积。脾中大多数巨噬细胞显示有许多有吞噬作用的红细胞和含铁血黄素沉积或蜡样色素（图4A）。电子显微镜下的脾脏，可见护套组织中的网状细胞在包含了众多的含铁血黄素电子致密细颗粒。（图4B）。网状细胞的护套组织和血窦坏死并显示许多CLV

17、颗粒，在电子透亮的细胞质中有许多狭窄管状，含有结晶夹杂电子致密物质，和胀扩大的内质网（图4C）。 肾脏显示出肾小管上皮细胞混浊肿胀，空泡变性并伴随有核变性，管状破坏随后坏死（图4D）。有时，这些受影响肾小管细胞，像正常肾小管上皮细胞一样，含有含铁血黄素颗粒。肾小球包含的坏死细胞有时会被部分摧毁。这些坏死性病变并没有表现出任何细菌入侵的证据。在电子显微镜下，空泡肾小管细胞显示出有巨大的空余空间，变圆，线粒体发生退化，电子透亮细胞质发生网状扩大（图5A）。凝固性坏死的肾小管细胞表现出浓缩线粒体中的嵴消失。在整个细胞（图5B）中沉积许多为二价阳离子的基层电子致密颗粒。此外，坏死的肾小管上皮细胞有明显

18、破裂的嵴且扩大了的线粒体和在电子透亮细胞质中的广大RER（图5C）。因此，在细胞质或管状细胞周围的任何细菌细胞内都没有显示出任何能影响肾小管细胞的CLV粒子。在造血组织中，有广泛的坏死细胞和少量巨噬细胞显示有吞噬红细胞和含铁血黄素沉积。在电镜下，各种各样的细胞坏死且显示出许多CLV颗粒，在电子透亮细胞质中电子致密物质含有结晶夹杂物和管状结构。图. 3. 鲤鱼在自然中爆发。（A）在心肌外层，出血发生在肌肉受损纤维中。内层心肌纤维是高度空泡化。 HE。比例尺=100微米。（B）心肌纤维的电子显微照（米），肌原纤维束支离破碎呈现肿带型。一个开放的箭头指示许多肿胀与嵴破坏的线粒体。黑色箭头示出许多凝固

19、线粒体。糖原颗粒消失在一个高度空泡的肌浆中。比例尺=1微米。（C）在肝脏中，肝细胞显示出颗粒状且肿胀的外观。一个箭头指向含铁血黄素的巨噬细胞在正弦位置。 HE。比例尺= 50微米。（D）电子显微照片中饭肝细胞呈现混浊肿胀。细胞拥有2膨胀核边际显示染色质沉积，有明显损管状嵴且膨胀的线粒体破，破碎膨胀扩大的粗面内质网（RER），而在电子透亮细胞质中没有糖原颗粒。比例尺=1微米。图. 4.鲤鱼在自然中爆发。（A）脾脏中巨噬细胞中有许多吞噬红细胞和柏林蓝染色为阳性含铁血黄素沉积。比例尺=100微米。（B）从电子显微照片中观察到,脾脏的保护组织中有吞噬作用的巨噬细胞存在。它们包含许多含铁血黄素电子致密细

20、颗粒。比例尺=2微米。（C）病毒感染的电子显微镜照片中，网状细胞排列在脾窦内。出现许多CLV颗粒（箭头）和管状结构。小箭头指向细胞质中CLV病毒粒子。一个大箭头指示出从细胞释放出来的CLV病毒粒子。比例尺= 900纳米。 (D)肾脏中，显示许多肾小管上皮细胞空泡变性，坏死，肾小管被破坏。 HE。比例尺=100微米。 H：含铁血黄素颗粒的团块; R：网状纤维; S：脾窦。 图.5 .健康鲤鱼。（A-C）自然病鱼。（A）电子显微照片中肾小管上皮细胞呈现空泡变性。电子透亮细胞质有空泡变圆且退化的的线粒体。比例尺= 5微米。（B）在电子显微图中，肾小管上皮细胞呈现凝固性坏死。显示有无嵴凝集的线粒体，整

21、个细胞中沉积有许多电子二价阳离子的致密颗粒。比例尺=4微米。（C）电子显微镜图可见坏死的肾小管上皮细胞。它们有边缘色素沉着的细胞核，嵴破损的增大线粒体，电子透亮细胞质中的增大RER。比例尺=2微米。（D）在没有表现外部病变实验病鱼的造血组织的电子显微图。坏死的细胞含有许多CLV颗粒（箭头）。比例尺=2微米。 B：肾小管上皮基底膜; C：毛细管上肾小管。共养的感染实验 共有30条实验鲤鱼经历与自然患病鲤鱼的同居，其中28条死亡或濒死再第4日至28天之间（图6）。在实验结束后只有2条活且着没有发生任何病理变化。一共有8条濒死的鱼除了仅在受伤部位有轻微出血外没有其他任何迹象。这8条鱼中有五条濒死在第

22、4天和6天之间，其他3条濒死在第10天和16天之间。这些垂死的鱼组织显示在脾和造血组织有大量的坏死细胞。其心肌纤维呈萎缩性或空泡化。 电子显微镜显示在脾和造血组织的坏死细胞中有许多CLV的粒子（图5D）。与此相反，一共有20条鱼显示溃疡性皮肤病变。在4条鱼中，溃疡性病变形成在伤口部位且它们濒死于第4天。溃疡性病变表现坏死的真皮被许多细菌细胞入侵。这些鱼在内脏器官显示的病理变化同发生在垂死鱼的病理变化相似，且没有外部迹象。在7天后剩余16鱼变得奄奄一息且通常显示皮肤溃疡不仅发生在伤口部位，此外，在其他一些身体部位也发生规模囊水肿，眼球突出和腹水等症状（图1B）。溃疡性病变显示的病理组织学特点大多

23、于自然爆发找到的那些相同。病变显示规模囊水肿水肿的变化和真皮和外侧肌肉的出血（图7A）。在溃疡性病变及病变水的皮肤肿中，成纤维细胞经常含有CLV颗粒。其内脏器官也表现出于自然爆发中相同病理迹象。心肌纤维呈萎缩或空泡化，并包含CLV颗粒，肌原纤维束支离破碎，线粒体退化，内质网扩大且无糖原颗粒（图7B）。在一些鱼中，心腔包含许多裂解红细胞且外层心肌出血。在肾脏，在肾病变化的肾小管细胞通常会发生但于自然爆发的那些鱼比较发生较少（图7C）。在造血组织中，坏死细胞包含许多CLV颗粒，含电子致密物质有结晶内含物和管状结构存在（图7D）。此外，巨噬细胞中吞噬红细胞和含铁血黄素，和嗜酸性粒细胞数量增加。脾脏通

24、常包含大量的坏死细胞和含吞噬红细胞和含铁血黄素的巨噬细胞。在肝脏中，表现出的肝细胞混浊肿胀，并拥有管状嵴受损的线粒体，扩大内质网和次级溶酶体。在大多数的这些20条鱼，嗜水气单胞菌从可从溃疡性病变或腹水中分离。CLV也可从脾脏分离。图7.鲤鱼（A-D）实验病鱼表现皮肤溃疡。（A）在水肿患处皮肤，真皮和外侧的肌肉是广泛水肿和出血。 HE。比例尺=200微米。（B）心肌纤维的电子显微照片。肌原纤维束支离破碎呈现肿带型。线粒体拥有零散嵴。糖原颗粒消失。比例尺=1微米。（C）在肾脏中，大部分肾小管上皮细胞是坏死并裂解。 HE。比例尺=100微米。（D）造血组织电子显微镜照片。一个坏死的细胞含有许多CLV

25、颗粒（箭头），含有结晶夹杂物和管状结构的电子致密物质。巨噬细胞，红细胞，嗜酸性粒细胞数量增加。比例尺=2微米。人工感染嗜水气单胞菌 注射了加有5鲤鱼血清HI肉汤和LB肉汤培养的细菌，所有的鱼没有显示任何死亡或任何病理变化，在实验期间，即使在注射部位的身体。在大多数的鱼中，细菌没有从肾脏再次分离。在任何被检查鱼器官内脏中也未出现明显的组织学变化。讨论 Viremia-associated ana-aki-byo是在日本锦鲤中流行的一种病毒。我们确定肌肤溃疡性病变是CLV细菌通过水传播二次入侵进入皮肤被损坏真皮（Miyazaki等人，2000）。A和嗜水气单胞菌混合感染发生会使患病鲤鱼显示除了皮肤

26、溃疡以外地规模囊水肿，眼球突出及腹水等症状。这些水肿变化没有在只由CLV感染患病的鲤鱼中观察到。（Miyazaki等人，2000）。与此相反，感染A与嗜水气单胞菌会造成鲤鱼水肿变化和皮肤出血，但不会发生皮肤溃疡。在传输实验的同居自然患病鲤鱼中，皮肤已经受伤实验鲤鱼会濒死并展出1的2种不同类型的外部特征：没有外部标志，或同时发生水肿体征和皮肤溃疡。在垂死的鱼没有外部迹象，有严重心肌损伤，脾和造血组织广泛坏死。此外CLV可成功分离，显微镜显示坏死细胞有许多CLV颗粒。这些结果表明，由于病毒CLV致使这些鲤鱼濒死。这些鱼的症状与那些通过腹腔内接种CLV人工感染的鱼相同（Miyazaki等人，2000）。自然病鱼真皮纤维细胞和毛细血管内皮细胞含有CLV颗粒。VLC似乎是通过损坏表皮被释放到水中。因此，健康的鲤鱼通过轻微的伤口获得来自患病鲤鱼体内病毒。 与此相反，除了皮肤溃疡显示水肿体征实验患病鲤鱼显示心肌出血，肝细胞变性，肾病和含铁血黄素沉着。电子显微镜显示出真皮损伤纤维细胞，心肌纤维，脾细胞和造血细胞中的CLV颗粒，从而确定CMV感染，含铁血黄素沉着似乎是由溶