Transwell试验方法

1、Transwell细胞侵袭实验与移动实验一、试剂和耗材1) 细胞及细胞培养基： KYSE150细胞、含 10%FBS的 RPMI1640培养基及无血清 RPMI1640培养基。2) 10×PBS (pH7.0) ：Na2 HPO4·12H2 O （ MW 358.4）2.87gKH2 PO4（MW 136.09）0.2gNaCl（ MW 58.44）8.0gKCl （MW 74.55）0.2g去离子水至 100 ml高压灭菌后，室温保存。使用液为1×PBS(用无菌水进行1：9 稀释 )。3) 冰乙酸 : 甲醛（ 1:3 ）4) Transwell 小室 (BD,

2、Bioscience)5)Matrigel基质胶（ BD, Bioscience，50ug/ml ）：商品化，保存-20 °。6)各种规格的枪头、1.5ml 离心管及10ml 玻璃离心管：高温灭菌后备用，其中准备一些枪头与1.5ml 的离心管于-20 oC 预冷，备用。7) 5810R 台式高速冷冻离心机（ Eppendorf ）， TC10全自动细胞计数仪（ Bio-Rad ）8) 细胞计数板、 6 孔板二、实验步骤（一）侵袭实验1. 润化： 在无菌台上取出 Transwell 小室，置于 24 孔培养板内，小室内和放小室的孔内均用加少量无血清培养基，润化 5-15min 。2.细

3、胞准备： 在做实验前12h，弃去培养基，用PBS洗三次，每瓶细胞加入5ml 无血清培养基，常规培养24h。3. 细胞的接种：1)弃去无血清培养基，常规胰酶消化细胞，若室温过低可置于37培养箱中消化，消化时间不宜过长，控制在1min 以内。2)加入 4预冷的无血清培养基（建议6 孔板 2ml，培养瓶5ml），轻轻吹打均匀后，收集至10ml 玻璃离心管中（带螺口盖子），水平转子4、 700rpm/min ，离心 5min ；3) 弃除上清，适量无血清洗涤细胞并离心；4) 弃除上清，加入适量无血清培养基重悬细胞（根据细胞消化前满度进行初步稀释，建议初步稀释至细胞密度大于 1.5 ×10 5

4、 /ml ），轻轻吹打均匀后，取 10ul 细胞悬液用于 Bio-Rad TC10 细胞计数；亦可取 15ul 细胞悬液与等体积台盼蓝染液混合后取10ul 用于 Bio-Rad TC10 活细胞计数；5)计数后，取无血清培养基重悬一定体积的细胞悬液，将细胞密度调整至1.25 ×105 /ml ；6)将一定数量 Transwell 小室放入 BD公司 24 孔板，取上述细胞悬液400l （含 5×10 4 细胞）逐滴加入小室；取 500l含 10%血清的培养基沿小室侧壁与孔壁的空隙处加入到孔中，并保证小室膜与培养液之间无气泡。7)将接种好的细胞放入培养箱，237、 5%CO条

5、件下常规培养 24h，此过程不宜晃动细胞板。4. 细胞染色及拍照：1) 弃孔内培养基，将小室取出，弃去孔中培养基，PBS漂洗 3 次，将小室内 PBS吸干净，此过程要求快速完成，避免让小室的膜过于干燥，将小室置于已加入500ul固定液的培养孔中，在上室中加入200ul固定液，固定5-10 分钟左右。此过程要将保证培养板盖有盖子，以防挥发。2) 弃去孔中固定液， PBS漂洗 3 次，将小室内 PBS吸干净，将小室置于已加入 500ul 苏木素染液的培养孔中，上室中加入 200ul 固定液，染色 10-15min 。3) 将小室转移至新的培养孔中，水洗至适当颜色，用棉签擦拭去小室内部未穿过上室膜面

6、的细胞。4)往小室内加入100ul PBS，倒置显微镜观察穿过去的细胞，200×光镜下计数10 个视野的侵袭细胞数, 取其平均值 , 以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞的侵袭能力。5) 若颜色偏浅，可以置于染色液中重复染色，水洗至适当颜色后即可。（二）移动实验1. 小室润化： 在无菌台上取出 Transwell 小室，置于 24 孔培养板内，小室内和放小室的孔内均用加少量无血清培养基，润化 5-15min ，备用。2.细胞准备： 常规培养细胞，用PBS（已灭菌）或无血清培养基洗涤3 次后，加入常规量无血清培养基饥饿12h。3. 接种 Transwell 小室1)弃去无血清培养基，常规胰

7、酶消化细胞，若室温过低可置于37培养箱中消化，消化时间不宜过长，控制在1 分钟以内。2)加入 4预冷的无血清培养基（建议6 孔板 2ml，培养瓶5ml），轻轻吹打均匀后，收集至10ml 玻璃离心管中（带螺口盖子），水平转子4、 700rpm/min ，离心五 min；3) 弃除上清，加入适量无血清培养基重悬细胞（根据细胞消化前满度进行初步稀释，建议初步稀释细胞密度大于 1.5 ×105 /ml ），轻轻吹打均匀后，取10ul 细胞悬液用于Bio-Rad TC10 细胞计数；亦可取15ul 细胞悬液与等体积台盼蓝染液混合后取10ul 用于 Bio-Rad TC10 活细胞计数；4)计数

8、后，取无血清培养基重悬一定体积的细胞悬液，将细胞密度调整至1.25 ×105 /ml ；5)将一定数量Transwell小室放入BD公司 24 孔板，取上述细胞悬液400l 逐滴加入小室；取500l 含 10%血清的培养基沿小室侧壁与孔壁的空隙处加入到孔中，并保证小室膜与培养液之间无气泡。6)将接种好的细胞放入培养箱，37、 5%CO2条件下常规培养24h，此过程不宜晃动细胞板。4. 细胞染色（ Giemsa 试剂盒）及拍照：（三） Transwell 小室重复利用处理方法1 拍照结束后，将小室直接放入6 孔板 /24 孔板中，小室上下均加入适量胰酶，使膜浸泡在胰酶中，室温放置过夜（约 6h 以上）；2 将小室取出，用75%乙醇浸泡5min（可将小室全部没入乙醇中），重复三次，以除去苏木素染色；3 无菌水漂洗几次以除去残留物质，