海藻糖的研究进展

1、大庆师范学院本科生毕业论文海藻糖的研究进展院(部) 专业生物工程学院 生物技术 研 究 方 向 微生物发酵 学 生 姓 名 武鹏仁 学 号 201101122599 指导教师姓名 郎亚军 指导教师职称 讲 师 2015 年 5 月 26日摘 要海藻糖是一种在自然界中广泛存在的非还原性双糖，具有低聚糖的一般特性，化学性质稳定，能够在热、干燥、氧化等环境中保护生物组织和活性大分子在功能和活性，具有重要的生物学功能。海藻糖因其独特的生物学特性而广泛应用于食品、农业、化工、医药等领域。本文就海藻糖的来源、性质、制备、检测方法及在各领域的应用进行综述。 关键词：海藻糖；性质；应用前景；检测方法Abstr

2、actTrehalose is a widespread in nature non-reducing disaccharide, oligosaccharides having the general characteristics, chemical stability, to protect the active molecules in biological tissue and the function and activity in hot, dry and oxidation environmentIt has important biological functions. Tr

3、ehalose its unique biological characteristics and are widely used in food, agriculture, chemical and pharmaceutical. This paper reviewed on the source of trehalose, nature, preparation, testing methods and applications in various fields.Keywords: Trehalose; properties; application prospect; detectio

4、n method目 录摘 要IAbstractII目 录III1 引 言12 海藻糖的简介22.1 海藻糖的来源22.2 海藻糖的结构22.3 海藻糖的理化性质32.3.1 物理性质32.3.2 化学性质33 海藻糖的制备53.1 酶合成法53.2 酵母抽提法63.3 微生物发酵法63.4 基因重组法73.5 化学合成法74 海藻糖的检测方法84.1 蒽酮硫酸法84.2 高效液相色谱法84.3 纸层析法84.4 薄层层析法94.5 气相色谱法94.6 酶分析法95 海藻糖的应用105.1 食品中的应用105.2 精细化工方面的应用105.3 农业中的应用116 展 望12参考文献13致 谢14

5、1 引 言海藻糖是一种非还原性多糖，其结构是由两个葡萄糖分子通过，-1，1糖苷键连接。海藻糖最早是Wingger在19世纪初从黑麦的麦角中首次分离而得到的。经过科学的不断发展，人们发现海藻糖的存在不局限于黑麦中，它在动物、植物以及微生物体内也是广泛存在的。科学家们在研究沙漠植物时发现，卷叶柏在干旱时几乎死亡，吸收水分后又很旺盛；某些昆虫，即使在高寒、高温和干燥失水等恶劣条件下不冻结、不干死；某些咸水虾、面包酵母和线虫，如果将它们生物体内90%的水分脱去以后，其仍然能在获水后迅速复活；保存在大英博物馆里的莲属种子，150年复水后 85%都能发芽；在真空干燥密封的管里保存35年的真菌，任然能产生孢

6、子。这些生物对外界恶劣环境有特别强的抵抗力，根本原因是它们体内均含有海藻糖。海藻糖对生物体具有保护作用，能提高生物体抗干旱、抗冷冻以及抗高温的特性。因此海藻糖的存在对生物体来说具有极其重要的意义。早期人们认为海藻糖只是能量的储存形式，并不了解其的生物学机能。自从20世纪末，海藻糖的研究开发日益发达，市场需求量也逐步增加。但总是供不应求，目前全球海藻糖综合生产能力平均约为每年7万吨，而年需求量达15万以上。因此研究应用新型设备，新工艺来满足国内外市场具有重大意义。2 海藻糖的简介2.1 海藻糖的来源 1832年，Wiggers 在研究分离黑麦的麦角菌时，首次发现了海藻糖，标志着海藻糖问世，在自然

7、界中动物、植物、微生物体内，都可以寻找到海藻糖的踪迹。尤其在酵母菌、霉菌、食用菌、昆虫等各种生命体中最为常见，目前，酵母是海藻糖生产的主要原料，也就是海藻糖的主要来源。2.2 海藻糖的结构在自然界中，比较常见的海藻糖是带有两个结晶水的二水化合物，它可以以多种固体形式存在，其分子式为C12H22O112H2O。20世纪初，科学家利用核磁共振技术阐述了其分子结构。海藻糖的二水化合物的分子和晶体结构通过X射线衍射分析得知，通过糖普键的氧原子，两个葡萄糖分子形成对称的空间结构，四个C12H22O112H2O单位排列形成正交晶体。经过进一步研究，海藻糖分子存在一种简单对称结构,若转动葡糖基连接的角度，能

8、够破坏这种对称的结构。对于果糖、乳糖、麦芽糖等双糖的结构受分子内葡糖基间氢键的影响，而海藻糖的二水化合物葡糖基间的氢键与它们不同，是通过水间接连接。从而它们的结构不同，氢键的平均长度变短，且结合力非常强。在低温（-150）的条件下，通过X射线对海藻糖的无水结晶体的结构进行研究，得知其的结构和二水海藻糖的结构相似。,型，,型和,型是海藻糖的三种光学异构体，最为常见的海藻糖是,型，其结构如图2-1、2-2所示。图2-1 海藻糖分子的结构式图2-2 海藻糖分子的构象式2.3 海藻糖的理化性质2.3.1 物理性质海藻糖的甜度是蔗糖的45%，熔点97，白色结晶，能溶于冰醋酸、水、热乙醇中，含2个H2O的

9、海藻糖结晶，溶解热为57.8kJ/mol，当加热到130时，海藻糖失去两分子的结晶水，变成无水晶体，熔点上升到214-216，溶解热下降，是53.kJ/mol，如遇含水物质，无水结晶海藻糖能有效地吸收该物质的水分子，变成含水结晶海藻糖。利用这个特性，人们将无水结晶海藻糖制作成生活中常用的脱水剂。（1）抗辐射性科学家在研究海藻糖有抗辐射实验中，通过一系列实验和数据分析得知，DNA分子在浓度为100mmol/l海藻糖存在的条件下，能够承受相于对照组43倍剂量的射线辐射，通过实验得知，当有射线辐射时，海藻糖有保护DNA的功能，后来发现，海藻糖不仅仅对射线有防辐射功能，对X、紫外射线都有防辐射功能，并

10、且在一定限度范围内，海藻糖浓度与其保护效果成正比。（2）低吸湿性相对湿度很高时，海藻糖2水结晶无吸湿性，相对湿度很低时，无水结晶有吸湿性。利用海藻糖这一性质，人们将无水结晶海藻糖当做天然脱水化合物使用，能使与它配合的物质的性质稳定地保存下来。能够使一些食品物质在高温干燥环境下，能够保存水分；在潮湿水分充足下又能不吸收多余的水分影响品质.2.3.2 化学性质在自然界天然双糖中，海藻糖是最稳定的糖，其的稳定性极强，只能够被特异性的海藻糖酶水解，即使加热海藻糖与蛋白质、氨基酸的混合物时，海藻糖也不发生美拉德反应，具有良好的耐热性和耐酸性。具体稳定性如表2-1。表2-1 海藻糖的稳定性检测项目稳定性情

11、况pH稳定性pH3.5-10，100，24h，99%不残存水溶液稳定性90min， 120 ， 不褐变含氨基酸水溶液的热稳定性90min，沸水中，不褐变含蛋白质水溶液的热稳定性90min，沸水中，不褐变水溶液长期保存的稳定性12个月，37，不褐变，不分解3 海藻糖的制备 海藻糖能够从根本上保护蛋白质分子不变性失活，从而使生命体能够维持生命过程和基本生物特征。许多物种对外界恶劣环境具有强的抗逆耐受力，原因是它们体内含有大量的海藻糖。同样，自然界中还有许多糖类物质，例如蔗糖、葡糖糖，但不具备海藻糖对生物体保护作用的功能。这一独特的功能性质使得海藻糖在生活中的作用举足轻重，原料来源也广泛，因此对海藻

12、糖的研究与生产技术也越来越活跃。酶合成法、酵母抽提法、微生物发酵法、基因重组法、化学合成法等是现阶段制备生产海藻糖的常用方法。3.1 酶合成法 酶合成法的合成原理是以葡萄糖、淀粉、麦芽糖、寡糖等糖为底物，通过各自相对应的酶与其作用转化为海藻糖。合成海藻糖相关的酶如表3-1。表3-1 合成海藻糖相关酶类酶存在形式海藻糖酶多种生物海藻糖合酶脂肪杆菌恶臭假单胞菌嗜热菌海藻糖磷酸化酶Eueliot gracillisFlammtdina velutips海藻糖一6一磷酸酯酶大肠杆菌和酵母菌海藻糖一6一磷酸合酶大肠杆菌和酵母菌麦芽寡糖基海藻糖水解酶节杆菌麦芽寡糖基海藻糖合酶节杆菌 20世纪五十年代，日本

13、科学家从大地土壤中分离得到麦芽寡糖基海藻糖合酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶，这两种酶能够与多种淀粉作用，最终将淀粉转化成海藻糖。在麦芽寡糖基海藻糖合酶的作用下，淀粉的部分分解产物可以在分解产物的末端生成具有海藻糖结构的非还原性糖；麦芽寡糖基海藻糖水解酶能从非还原性糖质中分离出海藻糖。孙长慧做过一个实验，以淀粉为原料，利用一株产麦芽寡糖基海藻糖合酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶的微球菌， 在酶反应温度30，pH值为8.0，在浓度为100 mol/L缓冲液和底物质量分数为20%底物条件下，2024h的反应时间，得到海藻糖质量浓度为53 g/L，淀粉转化率为54%。科学家经过大量实验和数据分析结果表明，温度3

14、840，pH值6.36.7，淀粉水解液的质量分数为15%的条件是合成麦芽寡糖基海藻糖合酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶联合作用的最佳条件。目前，在众多的酶合成法生产海藻糖中，麦芽寡糖基海藻糖合酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶协同作用于淀粉来生产海藻糖是最为普遍使用的，具有产率高、原料回收率高等优点，比其他生产工艺较成熟。3.2 酵母抽提法在所有的海藻糖生产方法中，酵母抽提法是最原始的。其原理是从微生物发酵液中提取生产的方法，简明的合成途径是：在海藻糖-6-磷酸合酶催化尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖的条件下得到6-磷酸海藻糖，再将产物在海藻糖-6-磷酸酯酶的催化下生产海藻糖最终成品。当生物体细

15、胞受到恶劣环境胁迫时，生物体为了缓解或消除这种胁迫作用，因此，生物体本能反应是体内大量合成海藻糖。利用这一原理，工业上为了提高海藻糖的产量，人为的适当提高温度和高压处理酵母，海藻糖提取率比没处理之前显著提高。也可以在在发酵末期一定范围内提高温度并且减少通风量，延时23h，海藻糖质量分数明显增大。大量的海藻糖储存在酵母细胞中的细胞质和子囊孢子中，如果采用破壁技术提取海藻糖，酵母细胞内的其他许多物质会与海藻糖混合，给下游的提纯以及精制会带来很多难题。所以，为了减少其他杂质的含量，破壁技术可以用渗透细胞技术来替换，通过这种方法，能够使小分子量的海藻糖透过细胞壁，大分子量的物质不能透过细胞壁，实现海藻

16、糖的初步分离，这时，大量的海藻糖在抽提液中，接着对抽提液进行脱杂、浓缩和结晶等流程得到成品，是提高海藻糖成品纯度的一个方法。3.3 微生物发酵法 由于海藻糖广泛存在于易繁殖的微生物中，可进行液态深层发酵，因此，海藻糖生产用微生物发酵法具有独特的优越特性。利用微生物发酵法生产海藻糖，主要的操作步骤是通过诱变、细胞融合及基因重组等方法选育出能够高产海藻糖的菌株，在适宜的条件下进行发酵，最后采用有效分离提取技术对产物进行精制。目前，在选育海藻糖的大量菌株中，灰树花中海藻糖含量较高。研究发现，发酵pH值控制在6.07.0，温度控制在3040，培养时间48 h，海藻糖产量会相对较高。提高种子产率和活力，

17、是微生物发酵法生产海藻糖的关键所在，随着科学技术的发展，若能够选育出胞外积累海藻糖的菌株，则对降低生产成本会发生跨时代的变化。目前，还没有培育出胞外积累海藻糖的菌株，有待发展。3.4 基因重组法基因重组法是最新的一种研究方法。这种方法主要有两个目的：其一，利用先进的技术手段改进海藻糖的生产，以最大限度的降低生产成本；其二，利用基因工程技术，将能够合成海藻糖酶的基因直接导入作物的基因中去，让其在作物中有效表达。美国Calgene公司用基因工程的方法将葡萄糖中转化成的海藻糖的酶基因，导入到植物当中，使其能制出海藻糖。当然，目标植物应具有产生糖的能力，并且葡萄糖转化为海藻糖会受有关酶的控制。能够生产

18、海藻糖的很多微生物中，均含有海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶和海藻糖-6-磷酸连接酶。例如，大肠杆菌能够生产海藻糖，其体内含有大量的海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶和海藻糖-6-磷酸连接酶。据有关资料记载，有人已利用嗜热古细菌克隆出了海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶和海藻糖-6-磷酸连接酶这两种酶的基因，嗜热古细菌常温可培养，产酶率也高，并且在高温下能利用直链淀粉或麦芽糖生产出海藻糖，目前世界上已经有公司研究出利用这一酶系产海藻糖的设备，具有很好的工业前景。3.5 化学合成法 海藻糖的化学合成法中，通常采用2，3，4，6-四乙酰基葡糖和3，4，6-三乙酰-1，2-脱水-D-葡糖作为反应物，在一定的反应条件下，由发生环

19、氧乙烷加成反应生成，但其制备分离困难，产率低，因此化学合成法在海藻糖的生产制备中并不多用，且生产过程中涉及较多的化学物质，在下游分离提纯工序难度较大，生产成本较高。还处于不成熟阶段，有待进一步研究。4 海藻糖的检测方法4.1 蒽酮硫酸法蒽酮硫酸法在定糖方法中比较常见，蒽酮硫酸法的原理是蒽酮能与醛类物质发生脱水缩合反应，而糖类物质在硫酸的作用生成糠醛，最终产生蓝绿色糠醛衍生物。其定量的依据是衍生物颜色的深浅。由于此方法是非特异性的，容易受到其他与其反应的试剂干扰。因此在用于海藻糖的检测时，要选择合适的提取方法。此方法偏值大，但价值便宜，因此在广泛用于海藻糖的常规检测。 4.2 高效液相色谱法高压

20、液相色谱是溶质在流动相与固定相之间的连续多次的一种交换过程，与其他色谱大体相同，其特点是高效、快速，对于海藻糖的定性分析比较理想。此方法的分离依据是借助溶质在固液两相之间的分配系数、吸附能力、亲和力以及分子大小不同来造成排阻作用，使不同溶质分离。检测样品在柱内的保留能力用保留值来衡量。定量的依据是溶质的量与峰面积存在一定范围内的正比关系。检测中影响分离效果的主要因素分别是温度、柱长、流动相、固定相以及进样量等。C18柱和氨基柱是常用来分离糖的色谱柱。其中C18柱对同分异构体的分离效果不及氨基柱。因此对色谱柱的选择也要根据情况来定。4.3 纸层析法纸层析法的操作最为简单而且费用也低，所以在被广泛

21、应用。显色剂和展开剂的选择是使用纸层析法的关键。用纸层析法检测海藻糖的展开系统中，所需要的试剂及其体积比为：水:丙酮酸:乙醇:正丁醇为2:3:4:5；醋酸:水:正丁醇为1:2:4；水:甲酸:乙酸乙酯为5:7.5:30；水:甲酸:正丁醇为10:15:75。经过多人实验发现，纸层析方法的洗脱剂选择也有很大难度，然而为了避免误差大和重现性差的问题，选择0.1mol/L的盐酸溶液作为该方法的洗脱剂，精确度相对较高，重现性也好。4.4 薄层层析法薄层层析法的基本原理和纸层析法的相同，也是用于对糖类进行定性分析，显色剂和展开剂的选择也是关键，但不同之处在与所用的固定相不同。薄层层析法的操作设备简单，对中间

22、试样的测定和菌种的选择都很容易，与薄层层析法相比纸层析法的重现性较好，因此用于定量分析。而薄层层析法在定量分析中主要应用于分离。4.5 气相色谱法气相色谱法被用于分离和检测糖组分上，分析时，需将不挥发性的糖制成具有挥发性的衍生物，三甲基硅烷基是用的最多的衍生物。与高压液相色谱法比较，气相色谱法操作干扰大，操作较繁琐，重现性和准确性也较差。所以，在海藻糖的分析应用中比较少见。4.6 酶分析法酶分析法的基本原理是，由于海藻糖性质及其稳定，只能与海藻糖酶发生特异性水解，所以，首先用海藻糖酶对海藻糖水解，再用葡萄糖氧化酶过氧化物酶系统对海藻糖水解后的葡萄糖进行检测。此方法是近些年来研究出的检测海藻糖的

23、新方法，其特异性较高，分析成本也高。检测时，因海藻糖酶的制备方法不同，所得海藻糖酶的种类也将不同，所以对检测结果会产生一定的影响。在以上6种检测方法中，高效液相色谱法最为理想，它的优点是能快速、准确的测定样品中的海藻糖含量；缺点是此方法使用的设备价格及其昂贵。但纸层析法和薄层层析法用的设备简单，价格适中，操作简单，因此是目前比较广泛应用的方法。5 海藻糖的应用5.1 食品中的应用 如今食品防腐中的食品质量安全性和稳定性是食品行业中最大的挑战。虽然食品防腐技术比以前大有成熟，却长时间放置，未过保质期，食品在成分上发生变性问题屡见不鲜。如将海藻糖的这一特性用于鲜蛋的保存中，将含量为3%的海藻糖与鲜

24、蛋混合，在大约45下干燥，会产生无气味黄色粉末，将其室温保存，食用时再水化，水化后产品和鲜蛋差别不大。海藻糖是一种保护剂， 与其他糖类相比，海藻糖甜度较低，不会焦糖化，在人体内容易被酶降解为葡萄糖吸收，所以在食品工业上可以作为一种新型的天然防腐剂。现今好多食品加工企业已经将海藻糖广泛应用，主要用于禽蛋类、奶类及番茄酱的保存。海藻糖还可以作为口感改良剂，将海藻糖与食盐共同存放，能保持食品优良的口味并且改善口感。5-1是海藻糖的性质及其对应的应用表，从表5-1可以看出，海藻糖产品可以应用到各种各样的食品和调味料中，从而可以大大改善食品的质量并增加食品的花色品种，促进食品工业的进一步发展。表5-1

25、海藻糖在食品工业中的性质及应用性 质应 用保鲜新鲜水果、蔬菜等低甜味冰淇淋、糖果、巧克力、口香糖等低吸湿性营养糖、快餐点心、保健食品等口感改良咖啡用糖、冰淇淋、调味料等低呈色性无油蛋糕、火腿、甜饼等抗淀粉老化糯米点心、面条等抗蛋白变性肉制品、蛋制品、乳制品和面团等热酸稳定性豆酱、茶和饮料、非油炸方便食品等5.2 精细化工方面的应用近些年来，随着科学技术的发展，大部分的生物表面活性剂是通过生物工程技术生产的，譬如海藻糖的工业化生产，其是生物表面活性剂家族中的重要组成成员。它不仅具有良好的表面活性功能，而且也可广泛用于纺织、日化、石油等工业。海藻糖用于紫外吸收剂、作为洁肤剂、皮肤保湿剂、口红、唇膏

26、的稳定剂和品质改良剂，主要利用了良好的保湿性能。5.3 农业中的应用海藻糖在农业方面也大有用武之地。海藻糖存在于高等植物体中已经被科学证明，但在大多数维管植物体中海藻糖的含量比较低，因此利用外源的海藻糖来研究海藻糖在逆境条件下对植物生理功能的影响，在一定条件下，温度越低，海藻糖的相对效应就越明显；海藻糖也能防止植物叶绿素的降解，以维持较高的根系活力，为高盐条件下的植物生长速率和干物质的积累提供了保障。另外，把海藻糖合酶基因导入植物中并使其在作物体内表达，将来也许会培育出一种能抗干旱、抗严寒、耐盐的新品种作物。而海藻糖对嗜热链球菌和植物乳杆菌菌体细胞的保护作用的研究表明：在冷冻干燥过程中，被海藻

27、糖保护的细胞存活率分别能达到75%和33%左右，而对照分别为19%和11%。 海藻糖广泛的引用于生活中各个领域，其中主要应用于食品、农业、化妆品、医疗和保健品等方面，如今，科学技术突飞猛进，将来海藻糖的应用会越来越广，生产成本会越来越低。6 展 望利用植物生产海藻糖是最有可能得到廉价产品的方法，国内外科学家正在进行转基因植物的研究，因此应加强运用分子生物学研究开发海藻糖制备新工艺。对于海藻糖保护生物分子的作用机制，目前3个假说都不能作出完美的解释，在今后的研究中应结合海藻糖晶体结构、物理构象和化学特性深入研究其保护作用机制。随着以淀粉为底物酶法生产海藻糖技术的成熟，海藻糖的价格大幅度降低，已由

28、原来的200300美元kg降为23美元kg，海藻糖价格的降低，使其引用范围扩大，广泛地应用于食品领域，故应深入研究海藻糖的功能特性，进一步扩大在食品中的应用，如对人体肠道调节机制，作为食品保鲜剂的保鲜机制和技术的研究等。 参考文献1 周青峰.海藻糖在食品加工上的应用.中国食品工业.1996,18(2):22-23.2 葛文光,于晓雨,唐传核.海藻糖提取工艺的研究.食品科学,1998,19(5):21-24.3 赵晓峰,吴荣书.海藻糖的功能特性及其应用J.广州食品工业科技,2004,20(2):151-154.4 Elbein A D.The metabolism of trehaloseJ.C

29、arbohydr Chem Biochem,1974,30(3):227-256.5 聂凌鸿等.海藻糖的生物保护作用J.生物化学,2002,21(3):206-208.6 肖丽蓉,肖金树,张友洪,黄盖群.海藻糖的引用及海藻糖的研究进展J.四川蚕业,2010,38(1):334-336.7 Freydiere M,Borman AM,Johnson EM.Evaluation of the commerscial rapid trehalose rest for the point of isolation identification of Candida glabrata isolares in primary culturesJ.Mycopathologia,2012,173(4):259-264.8 杨荣华,林家莲,周凌霄.海藻塘在食品工业中的应用J