生物分离工程电泳课件

1、生物分离工程电泳1electrophoresis生物分离工程电泳2电泳在生化分离中的应用 分离和纯化手段（实验室） 蛋白、酶、核酸纯化 基础理论研究 醋酸纤维薄膜电泳分析血清蛋白 琼脂对流免疫电泳分析病人血清，早期诊断肝癌 高压电泳分离肽段，研究蛋白质一级结构； 凝胶电泳技术分离分析酶，蛋白质，核酸生物分离工程电泳3电泳原理 指带电粒子在电场中朝与自身带相反电荷的电极移动的现象cathodeanode+-+生物分离工程电泳4带电颗粒 小离子：cl-, 甘氨酸离子 生物大分子：蛋白质、核酸等 蛋白质分子是由氨基酸组成的，而氨基酸带有可解离的氨基和羧基，是典型的两性电解质，在一定的ph条件下就会解

2、离而带电 生物分离工程电泳5用支持体的电泳技术1. 滤纸电泳2.醋酸纤维薄膜电泳3.薄层电泳4.非凝胶性支持体区带电泳 ( 淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等 ) 5.凝胶支持体区带电泳 ( 聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶 ) 不用支持体的电泳技术 tiselius或微量电泳 操作形式：1. 区带电泳2.等速电泳3.等电点电泳电泳形式分类生物分离工程电泳6电泳速度v = eze/(6r) +-z，reffe: 电场强度,v/cmz: 溶质的荷电荷数：溶液粘度e: 1.610-19c1. 粒子在电场中所受的力: f = eze 2. 粒子在液体中泳动所受的阻力：根据stoke定律f= 6rv平衡时：f

3、= f 恒定泳动速度:溶质的迁移率： u0= v/e=ze/(6r) 生物分离工程电泳7区带电泳生物分离工程电泳8影响泳动速度的因素frictioncharge外加电流电压分子量分子形状分子的等电点voltage+-+生物分离工程电泳9影响泳动速度的因素-1 带电颗粒的性质 所带净电荷的数量 颗粒大小 形状 v=eze/(6r)恒定泳动速度:生物分离工程电泳10影响泳动速度的因素-2 粒子的pi和溶液ph值 protein白蛋白2球蛋白 球蛋白 球蛋白pi4.05.065.17.1白蛋白 2球蛋白 球蛋白 球蛋白血清中的四种蛋白ph8.6的电泳缓冲液中电泳，泳动速度：生物分离工程电泳11影响泳

4、动速度的因素-3 外加电流电压 u ，e ，v (1) 常压电泳: u=100500v，e=210v/cm t=几小时至数天 适合于分离蛋白质等大分子物质(2) 高压电泳：u=5001000v，e=50200v/cm t=几分钟 分离氨基酸，肽，核苷酸，糖类等小分子物质 由于电压升高，电流也随之增大，故需冷却装置 v=eze/(6r)恒定泳动速度:生物分离工程电泳12影响泳动速度的因素-4 溶液的离子强度 i = (cizi2 )/2 保持足够缓冲能力前提下，离子强度要最小 溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动速度越 慢，反之越快 最适离子强度0.02 0.2 生物分离工程电泳13影响泳动速度的因

5、素-5 电渗作用 在电场中液体对固体支持物的相对移动滤纸电泳 celluloseph=8.6 电泳血清蛋白+-球蛋白-滤纸的纤维间具有大量孔隙带有负电荷与带电颗粒一样可以吸引正离子介质向阴极移动球蛋白: 颗粒大，净电荷少生物分离工程电泳14 电渗作用石英毛细管电泳 capillary electrophoresis ph3内表面带负电毛细管管壁分布有大量的硅烷醇（si-oh）阳离子被吸附在管壁而形成了双电层 v= v(电渗流)v(电泳)v (正) v (中)v (负)生物分离工程电泳15影响泳动速度的因素-6 对支持物的选择 支持物均匀，吸附力小，否则电场强度不均匀，影响区带的分离 琼脂糖和淀

6、粉在电场作用下易电离带负电荷，产生电渗流，应用范围受限制。聚丙烯酰胺凝胶常用。生物分离工程电泳16example 1 计划在0.82v/cm的电位梯度下，用凝胶电泳的方法将两种胞外蛋白质分离开来，这两种蛋白质的迁移率分别为4.110-5和5.1 10-5cm2/v.s。如果开始时混合物在凝胶上宽度为0.2cm，估计把这两种蛋白质分开需多长时间？在估算时，可忽略扩散的影响。 u0 = v/e=ez/（6r） 6.7hrs102.4t0.82v/cm/v.s)cm104.110(5.10.2cmvvlt525512解：溶质的迁移率为：生物分离工程电泳17凝胶电泳生物分离工程电泳18 凝胶电泳法铸

7、胶电 泳染色脱色凝胶电泳样本处理trypsin浓缩层胶体分离层胶体取出胶体染 色脫 色生物分离工程电泳19pierce 商品供应预铸胶片 梯度或固定浓度胶体 10, 12. 15 样本槽中性 ph 缓冲液拋弃式塑料外壳 胶体1 mm 厚度生物分离工程电泳20不连续凝胶电泳系统组成 1电泳系统ph胶体浓度缓冲液上层(负极) 缓冲液2样本溶液 3浓缩层胶体 6.8 4分离层胶体 胶体 5下层 (正极) 缓冲液 tris-hcltris-hcltris-glycine tris-glycine tris-glycine 8.3 8.3 8.3 8.3 5% 7.520% - - - 胶体不连续性有浓

8、缩样品的作用 生物分离工程电泳21浓缩层内的等速电泳生物分离工程电泳22浓缩层胶体中的三个主要作用角色 glycine: negative charged no net charge chloride ion:proteins:小分子大分子生物分离工程电泳23sds gel elecrtophoresis生物分离工程电泳24sds-page测定蛋白质相对分子量 page凝胶电泳分离、检测蛋白质根据蛋白质分子大小、形状及净电荷 在page中加入一定量的sds 蛋白质分子的迁移速度主要取决于分子量大小生物分离工程电泳25sds-page测定蛋白质相对分子量 sds：阴离子去污剂、水溶液中以单体和分

9、子团存在。 能破坏蛋白质分子之间及与其他分子间的非共价键，形成带负电荷的蛋白质-sds复合物，使蛋白质丧失了原有电荷状态，形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团。生物分离工程电泳26sds-page测定蛋白质相对分子量操作：分离胶12%浓缩胶5%加样电泳染色、脱色凝胶干燥确定分子量生物分离工程电泳27样品分子量的确定 m为蛋白质分子量、m相对迁移率、b为斜率、k为截距。 一定条件下k和b为常数，根据迁移率可求得分子量。lgmw=b*mr+k 蛋白质分子量在蛋白质分子量在15000-200000之间时，电泳迁移之间时，电泳迁移率与分子量的对手呈线性关系：率与分子量的对手呈线性关系：生物分离工程电

10、泳28样品分子量的确定相对迁移距离=蛋白质迁移距离/燃料迁移距离 以标准蛋白质相对分子量的对数以标准蛋白质相对分子量的对数(lgmr)为纵座标，为纵座标，相对迁移距离为横座标作图，得到标准曲线。相对迁移距离为横座标作图，得到标准曲线。生物分离工程电泳29三种不同性质蛋白质的电泳比较 molecular weightpinative pagesds-pagemobilityproteinquaternary structurex yztetramer(40,000)x4monomer88,000monomer60,0005.85.29.3fastslowmediumslowupwardfastx yz-+生物分离工程电泳30