实验五碱性磷酸酶米氏常数的测定

1、实验五碱性磷酸酶米氏常数的测定目的要求1 学习分光光度法测定的原理和方法2学习和掌握米氏常数（km）及最大反应速度 （$）的测定原理和方法，测出碱性磷酸酶 在以对硝基苯酚磷酸为底物时的绻和$值。、原理、分光光度法的基本原理及方法一）利用吸收光谱对物质进行定性分析1.原理0 <1005500-图11维生素b】2溶液的吸收光谱曲线2.主要方法：(1) 比较吸收光谱曲线(2) 比较最大吸收波长蛋白质的最大吸收波长为280nm，核酸的最人吸收波长 为260n m。2'$24u 250 2s0 27u 280 2&0 300 波长芳呑濮如£哉的些外吸收0<6 v吸

2、光。.4 度1 苯丙氨酸2酪氨酸3色氨酸(3) 比较吸光度的比值纯dna"260 8a280 tun）利用吸收光谱对物质进行定量分析1.原理beer-lambert （比尔）定律： t=l/|° a=lg1/t=lgl0/|a=kcl其为透光率；a为吸光率；|为入射 光强度；i为透射光强度;k諡蠶数；c为溶液浓度；l为溶液光2常用方法(1) 标准曲线法标准曲线与样品的测定条件必须一致。(2) 标准管法测定as、ax,cx/ax=cs/as，已知cs， 求得cx。(3) 摩尔吸光系数法吸光系g蕊錢系評诚l时的（三）米氏常数的测定原理酶促反应ts曲线v 5 m l v =推导岀

3、米氏方程为:k + sm 1-其中s为底物浓度；为初速度；$为最大反应速度; km另来氏常数米氏常数心是酶的一个基木特征常数，它包含 着酶与底物结合和解离的性质。特别是同一种酶能 够作用于几种不同底物时，米氏常数心往往可以反 映岀酶与各种底物的亲和力的强弱。测定&和$,可通过作图法求得。最常用的 lineweaver-burk双倒数作图法。这个方法是将米 氏方程转化为倒数形式，即：1 心 111v v s v以1/iz对1/s作图，可得一条直线本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐(pnpp) 水解的/和$反应式：pnpp+hq> pnp+hpo42-无色黄色可通过分光光度法测

4、定产物pnp的含量，求岀反应速度vo三、试剂与器材试剂:0.5ptmol/ml pnp、10 mmol/l pnpp、20 mmol£l mgci2> 0.1 mol/l 碳酸钠一碳酸氢钠 ph 10.1 缓冲液、0.1 mol/l naoh、6 |ng/ml碱性磷酸 酶酶液器材：f旦温水浴锅、722分光光度计四、分光光度计的使用1. 722型分光光度计的外形2仪器操作键介绍“方式设定”键（mode）:用于设置测 试方式“100%t/0abs”键：用于自动调整100.0%t（100.0透射比）或0abs（零吸光度） “0%t”键：用于自动调整零透射比“波长设置”旋钮：用于设置分

5、析波长3 样品测试操作 打开电源开关，使仪器预热20分钟 用“波长设置”按钮将波长设置在您将耍使川的分析波 k位晝上打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉 盖好样品室盖，按“0%t"键调透射比零 取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%调100%透射 比 按“方式键” (mode)将测试方式设置为吸光度方式 (a) 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽 卬，盖上样品室盖 将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%t”调零a 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测 样品的吸光度参数实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好

6、盖布。五、操作方法（一）对硝基苯酚标准曲线的制作取5支试管编号,0号一支,1 7号各二支，按下表操作：管号0 123456pnp含量(jimol)00.050.10 0.150.200.250.300.5)limol/nil pnp (ml)0 0.10.20.30.40.50.6h2o (ml)0.80.70.60.50.40.30.2na2co3-nahco3 (ml)各管加入l.oml20 mmol/l mgcl? (ml)各管加入0.2 ml0.1 mol/l naoh (ml)各管加入20ml°d 405 nm以对硝基苯酚的绝对量（ymol数）为横坐标，0。4。5诃值为纵址

7、标,绘制标准曲线。求出pnp的克分子消光系数值。(二)测定15支试管，1-5做两组平行测定管，01-05作为空白对照。no.12345底物终浓度s (mm)0.50.751.01.5310 mmol/l pnpp (ml )0.10.150.20.30.6蒸徭水(ml )0.50.450.40.30碳酸盐缓冲液(ml)各加1.0 ml20 mmol/l mgci2 (ml )各加0.2 ml预热混匀，37°c, 5分钟酶液(ml )测定管各加0.2 ml酶液反应时间37°c,精确反应10分钟0.1 mol/l naoh (ml)各加2 ml酶液(ml )空白管各补加0.2

8、ml酶液od405三）数据处理各管在722分光光度计测定波长405nm的0dfl（od405nm）o从对硝基苯酚标准曲线上查出od405nm相当于产物对硝基苯酚的含量gmol数）, 计算出各种底物浓度下的初速度 （单位以 pimol-u-min-1表示），取倒数1/iz填入表内。以 1/1/s作图，求出酶催化pnpp水解的米氏常 数kg和最大反应速度六、注意事项1. 取液量一定要准确。2. 反应时间一定要精确。3. 加酶前后一定要将试剂混匀。4. 空白对照一定要先加naoh,后加酶。5. 测定od405时要以各自的空白调零点。6. 移液管或取液器的使用7. 比色杯的使用返也加酶时间(min)0.511.52加naoh时间10.51111.52反应时间(min)10101010管号2 2f33&