PCR设计引物时酶切位点的保护

1、pcr设计引物时酶切位点的保护酶寡核苷酸序列切割率%2 hr20 hracc iggtcgacc cggtcgaccg ccggtcgaccgg0 0 00 0 0afl iiicacatgtg ccacatgtgg cccacatgtggg0 >90 >900 >90 >90asc iggcgcgcc aggcgcgcct ttggcgcgccaa>90 >90 >90>90 >90 >90ava iccccgggg cccccggggg tcccccggggga50 >90 >90>90 >90 >9

2、0bamh icggatccg cgggatcccg cgcggatccgcg10 >90 >9025 >90 >90bgl iicagatctg gaagatcttc ggaagatcttcc0 75 250 >90 >90bssh iiggcgcgcc aggcgcgcct ttggcgcgccaa0 0 500 0 >90bste iigggt(a/t)accc010bstx iaactgcagaaccaatgcattgg aaaactgcagccaatgcattggaa ctgcagaaccaatgcattggatgcat0 25 250 50

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4、c ggggtacccc cggggtaccccg0 >90 >900 >90 >90mlu igacgcgtc cgacgcgtcg0 250 50nco icccatggg catgccatggcatg0 500 75nde iccatatgg cccatatggg cgccatatggcg gggtttcatatgaaaccc ggaattccatatggaattcc gggaattccatatggaattccc0 0 0 0 75 750 0 0 0 >90 >90nhe iggctagcc cggctagccg ctagctagctag0 10 1

5、00 25 50not ittgcggccgcaa atttgcggccgcttta aaatatgcggccgctataaa ataagaatgcggccgctaaactat aaggaaaaaagcggccgcaaaaggaaaa0 10 10 25 250 10 10 90 >90nsi itgcatgcatgca ccaatgcattggttctgcagtt10 >90>90 >90pac ittaattaa gttaattaac ccttaattaagg0 0 00 25 >90pme igtttaaac ggtttaaacc gggtttaaaccc

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9、g tccccccgggggga0 25 50 >900 75 >90 >90注释：1如果要加在序列的5端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3端加上相应的碱基（黑色）。2切割率：正确识别并酶切的效率3。加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计pcr引物时，人为的在酶切位点序列的5端外侧添加额

10、外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的tm值和各引物的碱基分布及gc含量。如果某条引物tm值偏小，gc%较低，添加时多加g或c，反之亦反。为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，neb采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近dna末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。实验方法：用-32patp在t4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1a260单位的寡核苷酸。取1?g已标记了的寡核苷酸与20单位的内切酶，在20°c条件下分别反应2小