微生物限度检查作业指导书

1、 文件编号 文件版本号 微生物限度检查作业指导书负责部门 品管部页 码1010目的：建立微生物限度检查的标准操作规程，为微生物检验人员提供正确的操作方法。范围：适用于辅料、内包材料和所有产品的微生物限度检查。职责：检验人员对本规程的实施负责。参照标准：GB/T4789.3-2003,GB/T4789.15-2003,GB/T4789.2-2003内容：1 概述微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。供试品一般按批号随机抽样；抽样量应为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量（以备复检）。检验的全过程，均应严格遵守无菌操作，严防再

2、污染。2 仪器与用具恒温恒湿培养箱、生化培养箱、恒温水浴、高压蒸汽消毒锅、电热恒温干燥箱；试管、锥形瓶、量筒、培养皿（90mm）、刻度吸管、研钵；托盘天平或电子天平、镊子、剪刀、酒精灯、打火机、编号笔、75%酒精棉球；拖鞋、无菌衣、裤、帽、口罩。以上玻璃器皿、镊子、剪刀等洗净、晾干，160170干烤2h，备用。所有灭菌物品存放于第一缓冲间，不应超过2周即用毕。否则，应重新灭菌。3 培养基、试液配制营养琼脂培养基（细菌用）、孟加拉红培养基（虎红琼脂培养基，霉菌用）， 胆盐乳糖培养基（即BL，用于大肠杆菌增菌培养）、4甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）培养基（用于大肠杆菌快速检查）、麦康凯琼脂培养基（即

3、MacC，用于肠道菌分离培养）、蛋白胨水培养基（供靛基质试验用）、磷酸盐葡萄糖胨水培养基（供甲基红及VP试验用）、枸橼酸盐培养基（供枸橼酸盐利用试验用）；营养肉汤培养基、四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB，沙门菌增菌用）、胆盐硫乳琼脂（DHL）或沙门、志贺菌属琼脂（SS）培养基（用于沙门菌分离培养）、麦康凯琼脂或曙红亚甲蓝琼脂培养基（大肠杆菌及沙门菌分离培养用）、三糖铁琼脂（TSI）斜面培养基（肠道菌初步鉴别用）的配制及灭菌方法参见中国药典2000年版一部附录C。 0.1%2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液（供制备培养基用）、氢氧化钾试液（供作VP反应试剂）、萘酚乙醇溶液（供作VP试剂）、靛

4、基质试液。的配制及灭菌方法参见中国药典2000年版一部附录C。 稀释剂：0.9%无菌氯化钠溶液、无菌磷酸盐缓冲液（PH7.2）。4 操作过程4.1 试验前的准备4.1.1 将所有已灭菌的培养皿、锥形瓶、研钵、试管、吸管、量筒、稀释剂及供试品等通过传递窗进入无菌室内，每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入。将全部包装去掉，编号。4.1.2 开启紫外灯30分钟（或臭氧发生器1h）和空气过滤装置30分钟，进行空间灭菌处理。4.1.3 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外线杀菌灯（或臭氧发生器），进入缓冲间，换工作鞋。再用0.1%苯扎溴铵（新洁尔灭）消毒液洗手或乙醇棉球擦手，穿戴无菌衣、帽

5、、口罩、手套。4.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用乙醇棉球（或碘伏棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术剪刀将供试品瓶、盒、袋启封。启封后先检查包装内侧及周围有无生霉、长螨迹象，若经证实为生霉、长螨即可判为不合格，无须继续检验。4.1.5 定期检查无菌环境的空气是否符合规定。4.2 操作4.2.1 细菌、霉菌与酵母菌4.2.1.1 以无菌操作，称取检样25g(ml)，加入含225ml灭菌水的具玻塞锥形瓶中，振摇30min,即为1：10稀释液。 4.2.1.2 用灭菌吸管吸取1：10稀释液10ml，注入灭菌试管中，另用1ml灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。4

6、.2.1.3 取1支1ml灭菌吸管吸取1：10均匀供试液1ml，沿管壁加入装有9ml灭菌稀释剂的试管中，混匀即1：100供试液。以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至1：103或1：104，细菌选择两至三个稀释度，霉菌选择三个稀释度。4.2.1.4 在进行10倍递增稀释的同时，以该稀释级吸管吸取每级稀释液各1ml置每个灭菌平皿中，每稀释级注2个平皿。另取1支1ml吸管吸取稀释剂各1ml注入2个平皿中，作为阴性对照。4.2.1.5 将融化并冷至约45的培养基注入上述各个平皿约15 ml，以顺时针或反时针方向快速转动平皿（勿使培养基溢出）使供试液与培养基混匀，放置，待凝。4.2.1.6 将已凝固的

7、平板倒置于适宜温度的培养箱中，培养。细菌于36±1培养48±2小时，霉菌、酵母菌于2528培养，3天后开始观察，共培养观察5天。4.2.1.7 将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼用标记笔点计，以透视光衬以暗色背景，仔细观察，计数。4.2.2 大肠杆菌取胆盐乳糖培养基3份，每份100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌50100个作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。培养1824小时（必要可延至48小时）。阴性对照应无菌生长。取上述3份的培养物各0.2ml，分别接种至5ml MUG培养基管内培养，分别于5小时与24小时时，取未接种的M

8、UG培养基管作本底对照，将各管置365nm紫外光下观察。阳性对照管呈现荧光，MUG阳性。供试液的MUG管呈现荧光，MUG阳性：无荧光，MUG阴性。然后加数滴靛基质试液于MUG管内，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。当阴性对照呈阴性，阳性对照正常生长，供试液胆盐乳糖培养基培养液澄明，并证明无菌生长，判未检出大肠杆菌。供试液MUG阳性，靛基质阳性，判检出大肠杆菌；MUG阴性，靛基质阴性，判未检出大肠杆菌。如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，均应取供试液胆盐乳糖培养基培养物划线于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板，培养1824小时，如上述供试液培养物的分离平板无菌落生长，判未检

9、出大肠杆菌。或有菌落生长，应挑选23可疑菌落作靛基质试验（）、甲基红试验（M）、乙酰甲基甲醇生成试验（V-P）、枸橼酸盐利用试验（C）及革兰染色、镜检，按下表判断结果。MUGI曙红亚甲蓝琼脂IMVic结果+ +检出大肠杆菌 未检出大肠杆菌+ 无菌生长未检出大肠杆菌+ 有菌生长 + 检出大肠杆菌 +有菌生长+ + 检出大肠杆菌注：如出现+或出现+，均应重新分离菌株，再作MUG-I 和IMVic试验。 革兰氏阴性杆菌。4.2.3 沙门菌：取营养肉汤培养基3份，每份100ml，2份分别加入规定量的供试液，其中1份加入对照菌液作阳性对照，第3份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。培养1824小时，阴性

10、对照应无菌生长。取其余2份培养物各1 ml，分别接种于四硫磺酸钠亮绿培养基10 ml中，培养1824小时。分别划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基的平板上，培养1824小时或延至4048小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板无菌落生长，或有菌落但不同于下表所列特征时，可判为未检出沙门菌。培养基菌 落 形 态胆盐硫乳琼脂无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全黑色或无色沙门、志贺菌属琼脂无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色曙红亚甲蓝琼脂无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落麦康凯琼脂无色至浅橙色，透明或半透明

11、，菌落中心有时为暗色如供试品平板生长的菌落特征有与上表所列形态特征相符或疑似者，均应挑选23个菌落分别接种于三糖铁琼脂培养基斜面上，阳性对照同时接种该培养基，培养1824小时后，阳性对照的斜面应为红色，底层为黄色，硫化氢阳性，而供试品的疑似菌斜面未见红色、底层未见黄色，可判为未检出沙门菌。否则，应继续做靛基质试验、脲酶试验、赖氨酸脱羧酶试验、动力检查、血清凝集试验。5 注意事项5.1 供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死，损伤或繁殖。供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁开启。包装已开启的样品不得作为供试品。5.2 除另有规定外，供试品

12、制备成供试液后，应在均匀状态取样。制成供试液后，应在60分钟内注皿操作完毕。5.3 配制后的培养基应及时灭菌，避免细菌繁殖。培养基不应有沉淀，如发生沉淀，应趁热过滤。5.4 制备妥的培养基应在冷暗处保存，放置时间不能过长，锥形瓶的琼脂培养基保存时间最长不能超过一个月，以免水分散失染菌。5.5 勿用电炉直接融化琼脂培养基，以免营养成分过度受热而破坏。5.6 注皿时培养基应在45±1，高于45时易造成细菌受损或致死，低于45时易凝固，因此使用前应水浴保温。5.7 细菌、霉菌与酵母菌及控制菌必须做阴性对照试验（目的：测试检验全过程无菌技术的可靠性），控制菌必须做阳性对照试验（目的：检查供试

13、品是否对控制菌生长产生干扰作用，同时检查培养条件是否适宜）。5.8 阳性对照试验操作必须与供试品检验操作严格分开，避免交叉污染。5.9 做完试验后，用消毒液清洁，开紫外灯照射30分钟（或臭氧发生器1h）。6 结果判定菌数报告及结果判定按中国药典2005年版二部附录C。附件1 霉菌与酵母菌检验程序附件2 细菌检验程序附件3 大肠杆菌检验程序供试品 供试液 胆盐乳糖培养基 MUG-I MUG-I +MUG-I+ MUG-I+ + 判未检出大肠杆菌判检出大肠杆菌 EMB或麦康凯琼脂报告报告 有菌落生长无菌落生长 普通肉汤琼脂斜面判未检出大肠杆菌 枸橼酸盐VP试验甲基红试验靛基质试验革兰氏染色镜检报告 报告