酶工程原理及其在食品工业中的应用课件

1、酶工程原理及其在食品工业中的应用第三章第三章酶工程原理及其在食酶工程原理及其在食品工业中的应用品工业中的应用 酶工程原理及其在食品工业中的应用第一节第一节 酶工程原理和方法酶工程原理和方法 （一）酶工程的定义（一）酶工程的定义 利用利用酶、菌体细胞酶、菌体细胞具有的特异催化功能，具有的特异催化功能，或对酶结构进行修饰改造，并借助于生物反或对酶结构进行修饰改造，并借助于生物反应器和工艺优化过程，有效地发挥酶的催化应器和工艺优化过程，有效地发挥酶的催化特性来生产人类所需产品的技术。它包括酶、特性来生产人类所需产品的技术。它包括酶、细胞固定化技术、酶化学修饰技术和酶反应细胞固定化技术、酶化学修饰技术

2、和酶反应器设计等。器设计等。 酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程是现代生物技术的重要组成部分。酶工程是现代生物技术的重要组成部分。 以微生物或酶以微生物或酶为催化剂进行物质转化为催化剂进行物质转化的工业生物技术，大规模生产人类所需的的工业生物技术，大规模生产人类所需的化学品、医药、能源和材料等，是解决人化学品、医药、能源和材料等，是解决人类目前面临的资源、能源及环境危机的有类目前面临的资源、能源及环境危机的有效手段。效手段。酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程一般工艺流程示意图酶工程一般工艺流程示意图 胞外酶胞外酶 胞内酶胞内酶 菌种菌种基因改造基因改造发酵发酵发酵酶液（发酵酶液（预处理

3、预处理细胞细胞分离分离细胞破壁细胞破壁碎片分离碎片分离）提取）提取精制精制酶制剂酶制剂及其改造及其改造 酶制剂酶制剂 原料原料前处理前处理杀菌杀菌酶反应器酶反应器反应液反应液产品提取产品提取成品成品 酶工程原理及其在食品工业中的应用（二）酶工程的发展历程（二）酶工程的发展历程 1.201.20世纪世纪50506060年代早期的酶工程技术，年代早期的酶工程技术，主要是从动物、植物和微生物原料中提取、主要是从动物、植物和微生物原料中提取、分离、纯化制造各种酶制剂，并将其应用于分离、纯化制造各种酶制剂，并将其应用于化工、食品和医药等工业领域。化工、食品和医药等工业领域。 1949 大规模工业化阶段（

4、液体深层发酵）细菌大规模工业化阶段（液体深层发酵）细菌淀粉酶淀粉酶2.202.20世纪世纪7070年代后期，酶的固定化技术取得年代后期，酶的固定化技术取得了突破，使固定化酶、固定化细胞、生物反了突破，使固定化酶、固定化细胞、生物反应器与生物传感器等酶工程技术迅速获得应应器与生物传感器等酶工程技术迅速获得应用。用。 1969 日本固定化氨基酰化酶，第一次将固定化酶日本固定化氨基酰化酶，第一次将固定化酶成功地应用于工业生产。成功地应用于工业生产。酶工程诞生酶工程诞生 酶工程原理及其在食品工业中的应用 3. 3.目前，各种酶工程技术已用于制造多目前，各种酶工程技术已用于制造多种精细化工产品和医药产品

5、，并且在食品工种精细化工产品和医药产品，并且在食品工业、化学检测和环境保护等各个领域中得到业、化学检测和环境保护等各个领域中得到了有效的应用。了有效的应用。 酶的非水相催化酶的非水相催化 新酶的开发新酶的开发酶工程原理及其在食品工业中的应用（三）酶的分类：（三）酶的分类：按酶催化反应的类型分类按酶催化反应的类型分类v1氧化还原酶氧化还原酶v2转移酶转移酶v3水解酶水解酶v4裂合酶裂合酶v5异构酶异构酶v6连接酶（合成酶）连接酶（合成酶）酶工程原理及其在食品工业中的应用1氧化还原酶 (Oxidoreductase)CH3CHCOOHOHNAD+H+CH3CCOOHONADHv催化氧化催化氧化-

6、-还原反应，转移氢或加氧。还原反应，转移氢或加氧。v主要包括脱氢酶主要包括脱氢酶(dehydrogenase)(dehydrogenase)和氧和氧化酶化酶(Oxidase)(Oxidase)、过氧化氢酶、氧合酶、过氧化氢酶、氧合酶、细胞色素氧化酶。细胞色素氧化酶。v如，乳酸如，乳酸(Lactate)(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。脱氢反应。酶工程原理及其在食品工业中的应用2转移酶(Transferase)v转移酶催化基团转移反应，即将一个底转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。的分子上。 参

7、与生物物质的代谢参与生物物质的代谢例如，例如， 谷丙转氨酶催化的氨基转移反谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。应。CH3CHCOOHNH2HOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CHCOOHNH2CH3CCOOHO酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应用3水解酶(Hydrolase)H2OCOOCH2CH3RRCOOHCH3CH2OHv水解酶催化底物的加水分解反应（或逆反水解酶催化底物的加水分解反应（或逆反应）。应）。v主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。v例如，脂肪酶例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：催化

8、的脂的水解反应：酶工程原理及其在食品工业中的应用4裂合酶(Lyase)v裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。子形成双键的反应及其逆反应。v主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。v例如，例如， 延胡索酸水合酶催化的反应。延胡索酸水合酶催化的反应。HOOCCH=CHCOOHH2OHOOCCH2CHCOOHOH酶工程原理及其在食品工业中的应用5异构酶(Isomerase)v此类酶为生物代谢需要对某些物质进行分子异此类酶为生物代谢需要对某些物质进行分子异构化，分别进行外消旋、差向异构、顺反异构构化，分别进

9、行外消旋、差向异构、顺反异构等，分为差相异构酶、消旋酶、顺反异构酶等等，分为差相异构酶、消旋酶、顺反异构酶等 酶工程原理及其在食品工业中的应用6连接酶（合成酶）(Ligase or Synthetase)v合成酶，又称为连接酶，能够催化合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N 以及以及C-S 键的形成反应。这类反应键的形成反应。这类反应必须与必须与ATP分解反应相互偶联。分解反应相互偶联。vA + B + ATP + H-O-H =A B + ADP +Pi v例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。v 丙酮酸丙酮酸 + CO2 CO2 草酰乙酸草酰乙酸酶工程原

10、理及其在食品工业中的应用酶用于生物催化的概况类别类别占总酶比例占总酶比例% %利用率利用率% %水解酶水解酶 hydrolases2665氧化还原酶氧化还原酶oxidoreductases2725转移酶转移酶 transferases245裂合酶裂合酶 lyases125异构酶异构酶 isomerases51连接酶连接酶 ligases61酶工程原理及其在食品工业中的应用国际系统命名法国际系统命名法v系统名称包括底物名称、构型、反应性系统名称包括底物名称、构型、反应性质，最后加一个酶（质，最后加一个酶（-ase）字。）字。酶的系统编号：酶的系统编号：EC1.1.1.1v例如：例如：v习惯名称习

11、惯名称:谷丙转氨酶谷丙转氨酶v系统名称系统名称:丙氨酸：丙氨酸： -酮戊二酸氨基转移酮戊二酸氨基转移酶酶v酶催化的反应酶催化的反应: v谷氨酸谷氨酸 + 丙酮酸丙酮酸 -酮戊二酸酮戊二酸 + 丙丙氨酸氨酸 酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应用工业酶制剂的命名和分类工业酶制剂的命名和分类 分类：分类： 碳水化合物酶、蛋白质酶、酯酶和其他酶碳水化合物酶、蛋白质酶、酯酶和其他酶 如如 淀粉酶淀粉酶 高转化率糖化酶（葡萄糖淀粉酶）高转化率糖化酶（葡萄糖淀粉酶） 一些习惯归类：一些习惯归类：1、动物酶、植物酶、微生物酶、动物酶、植物酶、微生物酶2、胞内酶和胞外酶、胞内酶和胞外

12、酶3、溶液酶和固定化酶、溶液酶和固定化酶酶工程原理及其在食品工业中的应用二、酶制剂的生产二、酶制剂的生产 1.1.包括菌种的来源、产酶菌种的分离、包括菌种的来源、产酶菌种的分离、筛选、育种和酶的发酵生产等。筛选、育种和酶的发酵生产等。 2.2.酶生产菌的要求酶生产菌的要求 （1 1）不能是致病菌，特别是对食品用酶）不能是致病菌，特别是对食品用酶和医药用酶。目前认为可用于食品工业和医和医药用酶。目前认为可用于食品工业和医药工业的生产菌种有：枯草杆菌、黑曲霉、药工业的生产菌种有：枯草杆菌、黑曲霉、米曲霉、啤酒酵母和脆壁克鲁维酵母。米曲霉、啤酒酵母和脆壁克鲁维酵母。 （2 2）不易退化，不易感染噬菌

13、体。）不易退化，不易感染噬菌体。 （3 3）产酶量高，而且最好产生胞外酶。）产酶量高，而且最好产生胞外酶。 （4 4）能利用廉价的原料，发酵周期短，）能利用廉价的原料，发酵周期短，易培养。易培养。酶工程原理及其在食品工业中的应用3.酶的发酵方法酶的发酵方法1 1、固体培养发酵、固体培养发酵培养基以麸皮、米糠等为主要原料加入其它营养成培养基以麸皮、米糠等为主要原料加入其它营养成分，经灭菌、接产酶菌株，在一定条件下发酵，目分，经灭菌、接产酶菌株，在一定条件下发酵，目的获得淀粉酶和蛋白酶，如酒曲生产。的获得淀粉酶和蛋白酶，如酒曲生产。 2 2、液体深层发酵、液体深层发酵液体培养基，在发酵容器中，经灭

14、菌、冷却接入产液体培养基，在发酵容器中，经灭菌、冷却接入产酶细胞，在一定条件下发酵，是目前酶生产的主要酶细胞，在一定条件下发酵，是目前酶生产的主要方法。方法。 3 3、固定化细胞发酵、固定化细胞发酵酶工程原理及其在食品工业中的应用三、微生物细胞的破碎三、微生物细胞的破碎 胞外酶：能分泌透过细胞壁到细胞外部胞外酶：能分泌透过细胞壁到细胞外部的酶。的酶。 胞内酶：存在于细胞内部的酶。胞内酶：存在于细胞内部的酶。 对于胞内酶的提取，需要破碎技术，胞对于胞内酶的提取，需要破碎技术，胞外酶则无需破碎。破碎的目的是将细胞壁和外酶则无需破碎。破碎的目的是将细胞壁和细胞膜破坏掉，使胞内物质释放出来，包括细胞膜

15、破坏掉，使胞内物质释放出来，包括机械破碎法和非机械破碎法。机械破碎法和非机械破碎法。 酶工程原理及其在食品工业中的应用（一）机械破碎法（一）机械破碎法 1.1.高压匀浆法高压匀浆法 适合于细菌和酵母的破碎，不适合于丝适合于细菌和酵母的破碎，不适合于丝状真菌及某些基因工程菌。状真菌及某些基因工程菌。 2.2.珠磨法珠磨法 适合于各种微生物细胞的破碎。适合于各种微生物细胞的破碎。 3.3.超声破碎法超声破碎法 对杆菌的破碎较容易，对酵母菌的破碎对杆菌的破碎较容易，对酵母菌的破碎效果较差。效果较差。 酶工程原理及其在食品工业中的应用（二）非机械破碎法（二）非机械破碎法 1.1.酶溶法酶溶法 加酶法加

16、酶法: :常用的有溶菌酶、蛋白酶、糖苷酶等，常用的有溶菌酶、蛋白酶、糖苷酶等，它们对细胞壁或细胞膜进行酶解，使细胞破碎。它们对细胞壁或细胞膜进行酶解，使细胞破碎。 自溶法：在微生物生长代谢过程中，控制一自溶法：在微生物生长代谢过程中，控制一定条件，诱发微生物产生少量的溶胞酶或激发自定条件，诱发微生物产生少量的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。 2.2.化学渗透法化学渗透法 用有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素用有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素或金属螯合物等处理，使细胞壁或膜的通透性或金属螯合物等处理，使细胞壁或膜的通透性（渗透性）改

17、变，从而使胞内物质有选择地渗透（渗透性）改变，从而使胞内物质有选择地渗透出来。出来。酶工程原理及其在食品工业中的应用四、酶的提取与纯化四、酶的提取与纯化 酶的提取酶的提取: :在一定条件下，用适当的溶在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称作酶的抽提，即初步纯化。常用过程，也称作酶的抽提，即初步纯化。常用的方法：盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液的方法：盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取、有机溶剂提取。提取、有机溶剂提取。 酶的精制酶的精制: :即高度纯化。常用的方法：沉即高度纯化。常用的方法：沉淀法、超滤法、色谱分离法、结晶法

18、等。其淀法、超滤法、色谱分离法、结晶法等。其中沉淀法和超滤法既可用于初步纯化，也可中沉淀法和超滤法既可用于初步纯化，也可用于精制。用于精制。 酶工程原理及其在食品工业中的应用 分离：分离：将酶从原料中抽提出来，并尽可将酶从原料中抽提出来，并尽可能少引入杂质，得到粗酶液能少引入杂质，得到粗酶液 纯化：纯化：将酶和杂质中分离开来，或者有选将酶和杂质中分离开来，或者有选择地将酶从包含杂质中分离出来，得到一定择地将酶从包含杂质中分离出来，得到一定纯度的酶。纯度的酶。酶工程原理及其在食品工业中的应用酶的纯化过程与一般蛋白质纯化过程相比的酶的纯化过程与一般蛋白质纯化过程相比的特点：特点： 1、特定的一种酶

19、在细胞中的含量较少，、特定的一种酶在细胞中的含量较少， 2、酶可以通过测定活力的方法加以跟踪。、酶可以通过测定活力的方法加以跟踪。 前者给纯化带来了困难，而后者却迅速前者给纯化带来了困难，而后者却迅速找出纯化过程的关键所在。找出纯化过程的关键所在。 理想的提取和分离纯化方法理想的提取和分离纯化方法：在提高酶的：在提高酶的比活的同时，要求酶回收率高，提取步骤比活的同时，要求酶回收率高，提取步骤少、工艺简单，成本低。少、工艺简单，成本低。酶工程原理及其在食品工业中的应用策略：策略：酶产品的质量要求酶产品的质量要求设定目标：（用途：医用、食品级、工业级或设定目标：（用途：医用、食品级、工业级或研究级

20、）研究级） 目标酶蛋白与主要杂质的性质目标酶蛋白与主要杂质的性质提取过程的设计应尽可能防止酶的损失，提取过程的设计应尽可能防止酶的损失，减少处理步骤。减少处理步骤。酶工程原理及其在食品工业中的应用提取方法的经济性和可分析性提取方法的经济性和可分析性 尽量减少添加剂的使用尽量减少添加剂的使用 尽早使用高效分离方法，将昂贵、费时的分尽早使用高效分离方法，将昂贵、费时的分离方法放在最后阶段。离方法放在最后阶段。 酶活力、蛋白浓度、纯度测定方法可行性酶活力、蛋白浓度、纯度测定方法可行性剂型（液体浓缩酶、粉状酶、精制酶、剂型（液体浓缩酶、粉状酶、精制酶、结晶酶等）结晶酶等）酶工程原理及其在食品工业中的应

21、用基本过程：基本过程：（一）、（一）、材料（选择）预处理及破碎细胞材料（选择）预处理及破碎细胞 1.胞内酶和胞外酶胞内酶和胞外酶 2.破碎细胞破碎细胞（二）、（二）、固液分离（固液分离（离心或过滤）离心或过滤） 酶的溶解性、稳定性酶的溶解性、稳定性酶工程原理及其在食品工业中的应用（三）、（三）、净化与脱色净化与脱色 絮凝剂絮凝剂 脱色处理脱色处理（四）、（四）、浓缩浓缩 （热量法、沉淀分离、膜分离）（热量法、沉淀分离、膜分离） （五）（五）纯化、结晶纯化、结晶 （干燥）（干燥）酶工程原理及其在食品工业中的应用提取和纯化方法：提取和纯化方法：（一）根据酶分子溶解度不同的方法（一）根据酶分子溶解度

22、不同的方法 通过改变某些条件，使溶液中某种物质的溶解通过改变某些条件，使溶液中某种物质的溶解度降低，从溶液中沉淀析出，达到与其他物质分离度降低，从溶液中沉淀析出，达到与其他物质分离的目的。的目的。 1.1.盐析沉淀法盐析沉淀法 通常采用的盐有硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、硫通常采用的盐有硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用，酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用，因为它在水中的溶解度大而温度系数小，不影响酶因为它在水中的溶解度大而温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。的活性，分离效果好，而且价廉易得。 盐析沉淀所得到的产品常含有大量盐分，一般盐

23、析沉淀所得到的产品常含有大量盐分，一般可用超滤或层析等方法脱盐，使酶进一步纯化。可用超滤或层析等方法脱盐，使酶进一步纯化。 酶工程原理及其在食品工业中的应用 2.2.等电点沉淀法等电点沉淀法 在酶的沉淀分离中，等电点沉淀法经在酶的沉淀分离中，等电点沉淀法经常与盐析沉淀、有机溶剂沉淀和复合沉淀常与盐析沉淀、有机溶剂沉淀和复合沉淀等方法一起使用，使其沉淀完全。等方法一起使用，使其沉淀完全。 3.3.有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 利用酶等物质在有机溶剂中的溶解度利用酶等物质在有机溶剂中的溶解度不同而使其分离。常用的有机溶剂有乙醇、不同而使其分离。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙酮、甲醇等。丙酮、异丙

24、酮、甲醇等。 4.4.复合沉淀法复合沉淀法 在酶液中加入某些高分子聚合物，例在酶液中加入某些高分子聚合物，例如，单宁，使它与酶形成复合物而沉淀下如，单宁，使它与酶形成复合物而沉淀下来，分离出沉淀后，再用适当方法将酶从来，分离出沉淀后，再用适当方法将酶从复合物中重新析出。复合物中重新析出。酶工程原理及其在食品工业中的应用（二）根据酶分子大小和形状不同的方法（二）根据酶分子大小和形状不同的方法 1.1.离心分离法离心分离法 在酶的提取分离纯化过程中，细胞的收集、细胞在酶的提取分离纯化过程中，细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离以及酶的纯化等往往要使用离心分碎片和沉淀的分离以及酶的纯化等往往要使用离心分

25、离。离。 酶工程原理及其在食品工业中的应用 2.2.体积排阻法体积排阻法 利用具有一定大小网状的凝胶颗粒利用具有一定大小网状的凝胶颗粒（固定相）填充柱的分子筛作用，利用（固定相）填充柱的分子筛作用，利用溶液中各组分的相对分子质量不同来进溶液中各组分的相对分子质量不同来进行层析分离的一种方法。常用的凝胶有行层析分离的一种方法。常用的凝胶有琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（SepharoseSepharose）、聚丙烯酰胺）、聚丙烯酰胺凝胶（凝胶（BiogelBiogel）和葡聚糖凝胶）和葡聚糖凝胶（SephadexSephadex）等。）等。 酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应

26、用 3.3.透析透析 透析膜可用动物膜、羊皮纸、火棉胶或塞璐透析膜可用动物膜、羊皮纸、火棉胶或塞璐玢等制成。使用时可做成透析管、透析袋或透析玢等制成。使用时可做成透析管、透析袋或透析槽等形式。槽等形式。 优点：设备简单，操作简便。优点：设备简单，操作简便。 缺点：时间长，若不更换水或缓冲液时，只缺点：时间长，若不更换水或缓冲液时，只扩散到膜内外平衡为止。透析结束时，透析袋内扩散到膜内外平衡为止。透析结束时，透析袋内的保留液体积较大，浓度较低。的保留液体积较大，浓度较低。 透析主要用于酶、蛋白质、核酸等生物大分透析主要用于酶、蛋白质、核酸等生物大分子的分离纯化，从中除去小分子物质。透析在酶子的分

27、离纯化，从中除去小分子物质。透析在酶纯化过程中极为常用，通过透析可以除去酶液中纯化过程中极为常用，通过透析可以除去酶液中的盐类、有机溶剂、低相对分子质量的抑制剂等。的盐类、有机溶剂、低相对分子质量的抑制剂等。 酶工程原理及其在食品工业中的应用 4.4.超滤超滤 借助于超滤膜将不同相对分子质量的借助于超滤膜将不同相对分子质量的物质分离的技术，是在一定的正压力或负物质分离的技术，是在一定的正压力或负压力驱动下，将料液强制通过一定孔径的压力驱动下，将料液强制通过一定孔径的超滤膜，部分小分子的溶质和溶剂透过膜超滤膜，部分小分子的溶质和溶剂透过膜而成为超滤液，而大分子的酶和蛋白质等而成为超滤液，而大分子

28、的酶和蛋白质等物质被截留，从而达到分离纯化的目的，物质被截留，从而达到分离纯化的目的，也可用于酶液的浓缩和脱色。超滤膜截留也可用于酶液的浓缩和脱色。超滤膜截留的颗粒直径范围为的颗粒直径范围为2 2200nm200nm，相当于相对，相当于相对分子质量分子质量10001000500000500000。 构成超滤膜的主要材料有醋酸纤维、构成超滤膜的主要材料有醋酸纤维、尼龙、聚砜、陶瓷等。尼龙、聚砜、陶瓷等。酶工程原理及其在食品工业中的应用（三）根据酶分子电荷性质的方法（三）根据酶分子电荷性质的方法 1.1.离子交换层析离子交换层析 根据被分离物质与分离介质（离子交根据被分离物质与分离介质（离子交换剂

29、）间异种电荷的静电引力的不同来进换剂）间异种电荷的静电引力的不同来进行物质分离的。不同离子交换剂上的可解行物质分离的。不同离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同，而使不离基团对各种离子的亲和力不同，而使不同物质分离。同物质分离。 离子交换剂根据活性基团的性质分为离子交换剂根据活性基团的性质分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。酶具有两阳离子交换剂和阴离子交换剂。酶具有两性性质，可用阳离子交换剂，也可用阴离性性质，可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。子交换剂进行酶的分离纯化。 酶工程原理及其在食品工业中的应用 2.2.电泳分离电泳分离 在外电场作用下，不同蛋白质离子所在外电场

30、作用下，不同蛋白质离子所带净电荷的多少和性质不同，因而其向两带净电荷的多少和性质不同，因而其向两极泳动的方向和速度也不相同，从而达到极泳动的方向和速度也不相同，从而达到分离的目的。为了减少对流扩散，电泳过分离的目的。为了减少对流扩散，电泳过程一般在浸透了缓冲液的聚丙烯酰胺凝胶、程一般在浸透了缓冲液的聚丙烯酰胺凝胶、淀粉胶等介质上进行。电泳分离的蛋白质淀粉胶等介质上进行。电泳分离的蛋白质量通常较小（约数毫克），常用作分析用。量通常较小（约数毫克），常用作分析用。但现在已发展了制备电泳，用这种方法制但现在已发展了制备电泳，用这种方法制备的酶，可以在介质中洗脱或直接从电泳备的酶，可以在介质中洗脱或直

31、接从电泳柱底部依次流出。柱底部依次流出。 酶工程原理及其在食品工业中的应用 3.3.等电聚焦电泳等电聚焦电泳 先从阳极顶端扩散装入一种酸（如磷酸），先从阳极顶端扩散装入一种酸（如磷酸），然后从阴极端扩散装入一种碱（如乙醇胺），用然后从阴极端扩散装入一种碱（如乙醇胺），用具有不同等电点的脂肪族聚氨基聚羧基化合物作具有不同等电点的脂肪族聚氨基聚羧基化合物作为两性电介质载体，当阴阳两极通电以后电介质为两性电介质载体，当阴阳两极通电以后电介质在一定范围内便形成在一定范围内便形成pHpH值梯度，当该载体电介质值梯度，当该载体电介质同样品一起电泳时，蛋白质便朝其各自等电点相同样品一起电泳时，蛋白质便朝其各

32、自等电点相等的等的pHpH值位置移动而被浓缩。值位置移动而被浓缩。 优点：不但可将各种酶精确分开，通过测定优点：不但可将各种酶精确分开，通过测定各段的各段的pHpH值还可以了解该酶的等电点。可以分离值还可以了解该酶的等电点。可以分离和检出等电点相差仅和检出等电点相差仅0.020.02的两种蛋白质成分。的两种蛋白质成分。 酶工程原理及其在食品工业中的应用（四）根据酶分子专一性结合的分离方法（四）根据酶分子专一性结合的分离方法 1.1.亲和层析亲和层析 酶的底物、底物类似物及酶的竞争性酶的底物、底物类似物及酶的竞争性抑制剂同酶之间有着较高的亲和力，可作抑制剂同酶之间有着较高的亲和力，可作为配基固定

33、于不溶性载体，可选择性地将为配基固定于不溶性载体，可选择性地将酶吸附而同杂质分离。然后可以通过改变酶吸附而同杂质分离。然后可以通过改变缓冲液的离子强度和缓冲液的离子强度和pHpH值的方法，也可以值的方法，也可以使用浓度更高的同一配体溶液或亲和力更使用浓度更高的同一配体溶液或亲和力更强的配体溶液，将酶洗脱下来强的配体溶液，将酶洗脱下来。 2.2.免疫吸附层析免疫吸附层析 利用抗原一抗体的高亲和性反应原理利用抗原一抗体的高亲和性反应原理进行酶的分离纯化。进行酶的分离纯化。酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应用（五）酶分离纯化的原则（五）酶分离纯化的原则1.防止酶失活防止酶

34、失活 这一原则要贯穿纯化工作的始终，在后期尤为重要。这一原则要贯穿纯化工作的始终，在后期尤为重要。 建立一个可靠和快速、易行的测定酶活方法建立一个可靠和快速、易行的测定酶活方法 物理因素、化学因素和生物因素导致酶失活物理因素、化学因素和生物因素导致酶失活2.分离纯化的环节的选择（经济、宜行）：分离纯化的环节的选择（经济、宜行）： 纯化倍数、酶活回收率和重现性纯化倍数、酶活回收率和重现性 （衡量优劣）（衡量优劣） 经济、可靠，建立灵敏、快速、特异、精确的检测经济、可靠，建立灵敏、快速、特异、精确的检测（酶活和蛋白质的含量）手段。（酶活和蛋白质的含量）手段。3、分离步骤、方法和成本间的关系、分离步

35、骤、方法和成本间的关系 提取、分离、纯化、制剂提取、分离、纯化、制剂酶工程原理及其在食品工业中的应用（六）酶的分离纯化应注意的问题（六）酶的分离纯化应注意的问题 1.1.要注意防止酶变性失活要注意防止酶变性失活 低温、不能过酸、过碱等。低温、不能过酸、过碱等。 2.2.酶分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质酶分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能除去，因此选择分离方法是应尽可能不破尽可能除去，因此选择分离方法是应尽可能不破坏酶所需要的条件。坏酶所需要的条件。 3.3.通过检测酶活性，为选择适当方法和条件通过检测酶活性，为选择适当方法和条件提供了直接依据。提供了直接依据。 一个好的酶分离纯化的方

36、法和措施是使酶的一个好的酶分离纯化的方法和措施是使酶的纯度提高倍数大，活力回收高，同时重复性好。纯度提高倍数大，活力回收高，同时重复性好。酶工程原理及其在食品工业中的应用（七）酶的纯度与酶活力（七）酶的纯度与酶活力 许多分离方法都可用于检验酶的纯度，实验室常许多分离方法都可用于检验酶的纯度，实验室常用聚丙烯酰胺凝胶电泳来检验酶的纯度。酶分子结用聚丙烯酰胺凝胶电泳来检验酶的纯度。酶分子结构高度复杂，同一种酶制剂，采用不同方法检验结构高度复杂，同一种酶制剂，采用不同方法检验结果可能不一致，酶的纯度应注明达到哪种纯度，如果可能不一致，酶的纯度应注明达到哪种纯度，如电泳纯、电泳纯、HPLCHPLC纯等

37、。纯等。 比活力：每毫克酶蛋白具有的酶活力单位数。比活力：每毫克酶蛋白具有的酶活力单位数。一般情况下，酶的比活力随酶的纯度的提高而提高。一般情况下，酶的比活力随酶的纯度的提高而提高。酶的纯度也可用酶的比活力来衡量。酶的纯度也可用酶的比活力来衡量。酶工程原理及其在食品工业中的应用酶活力测定方式有二酶活力测定方式有二：v1.测定一定时间内的化学反应的量测定一定时间内的化学反应的量 通常测定在一定时间内最适于酶的条件下通常测定在一定时间内最适于酶的条件下酶促反应产物的生成量。酶促反应产物的生成量。如蛋白酶的活力，可据酶催化酪蛋白水解如蛋白酶的活力，可据酶催化酪蛋白水解生成的酪氨酸与酚试剂作用蓝色反应

38、，再用生成的酪氨酸与酚试剂作用蓝色反应，再用比色法测定之。比色法测定之。v2.测定完成一定量反应所需的时间，测定酶测定完成一定量反应所需的时间，测定酶所催化的一定量底物的减少或一定量产物的所催化的一定量底物的减少或一定量产物的生成所需的时间，酶活力与之成反比。生成所需的时间，酶活力与之成反比。酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应用 测定酶活力可采用中止反应法、连续测定酶活力可采用中止反应法、连续反应法，或采用自动化酶分析仪操作进行。反应法，或采用自动化酶分析仪操作进行。 中止反应法中止反应法: : 在恒温反应系统中进行酶在恒温反应系统中进行酶促反应，间隔一定的时间，分

39、几次取出一定促反应，间隔一定的时间，分几次取出一定容积的反应液，使酶停止作用，然后分析产容积的反应液，使酶停止作用，然后分析产物的生成量或底物的消耗量。几乎所有的酶物的生成量或底物的消耗量。几乎所有的酶都可根据这一原理，设计出测定其活力的具都可根据这一原理，设计出测定其活力的具体方法。体方法。 酶工程原理及其在食品工业中的应用 连续反应法连续反应法: : 不需要取样中止反应，而是基不需要取样中止反应，而是基于反应过程中光谱吸收、气体体积、酸碱度、于反应过程中光谱吸收、气体体积、酸碱度、温度、黏度等的变化，用仪器跟踪检测反应温度、黏度等的变化，用仪器跟踪检测反应进行的过程，记录结果，算出酶活力。

40、连续进行的过程，记录结果，算出酶活力。连续法使用方便，一个样品可多次测定，但很多法使用方便，一个样品可多次测定，但很多酶反应不能用该法测定。酶反应不能用该法测定。 自动化酶分析仪自动化酶分析仪: : 从加样、启动反应、检从加样、启动反应、检测、数据记录及结果处理等，整个过程均由测、数据记录及结果处理等，整个过程均由仪器自动完成。仪器自动完成。酶工程原理及其在食品工业中的应用酶偶联法酶偶联法 指选择另一种酶与酶发生偶联反应，指选择另一种酶与酶发生偶联反应，即第一种酶即第一种酶E1所催化的产物作为所催化的产物作为E2的底的底物，通过测定第二个酶促反应产物的量物，通过测定第二个酶促反应产物的量变化来

41、测的活力，此法适用于活力不高变化来测的活力，此法适用于活力不高或所催化产物不便测定的一些酶活力测或所催化产物不便测定的一些酶活力测定。定。酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应用举例：举例：-淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定1.标准碘液法标准碘液法 原理：淀粉对碘呈蓝黑色的特异性逐渐消失，原理：淀粉对碘呈蓝黑色的特异性逐渐消失，消失的速率与酶活性有关。消失的速率与酶活性有关。方法：终止法方法：终止法 稀盐酸稀盐酸 测吸光度测吸光度2.DNS法法-淀

42、粉酶可随机地作用于淀粉中的淀粉酶可随机地作用于淀粉中的-1,4-糖苷糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。称为液化酶。方法：终止法方法：终止法 热变性热变性 测吸光度测吸光度酶工程原理及其在食品工业中的应用酶法分析酶法分析酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应用底物浓度对酶速的影响底物浓度对酶速的影响酶工程原理及其在食品工业中的应用酶法分析包括两个步骤：酶法分析包括两个步骤： 1

43、.酶反应酶反应 在适宜的条件下进行催化反应在适宜的条件下进行催化反应 2.检测检测 测定反应前后物质的变化情况，可以测测定反应前后物质的变化情况，可以测定底物的减少、产物的增加或辅酶的变定底物的减少、产物的增加或辅酶的变化化酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应用游离酶催化的缺点：游离酶催化的缺点： 1.稳定性差：在高

44、温、强酸、强稳定性差：在高温、强酸、强碱等外界因素下易失活。碱等外界因素下易失活。 2.酶的一次性使用酶的一次性使用:反应结束后，反应结束后，酶即使仍有活性，也难以回收，成本酶即使仍有活性，也难以回收，成本提高，难于连续化生产。提高，难于连续化生产。 3.产物的分离纯化较困难：酶与产物的分离纯化较困难：酶与产物混在一起。产物混在一起。六、酶的固定化六、酶的固定化酶工程原理及其在食品工业中的应用六、酶的固定化六、酶的固定化 （一）酶的固定化方法（一）酶的固定化方法 1.1.吸附法吸附法 （1 1）物理吸附法。酶被物理吸附于不溶性载体）物理吸附法。酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方法。吸附的载

45、体：包括无机载体的一种固定化方法。吸附的载体：包括无机载体（活性炭、石英砂、多孔玻璃、氧化铝、硅胶、磷（活性炭、石英砂、多孔玻璃、氧化铝、硅胶、磷酸钙）和有机载体（淀粉、谷蛋白、纤维素、葡聚酸钙）和有机载体（淀粉、谷蛋白、纤维素、葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺）等。糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺）等。 优点：具有不破坏酶活性中心和酶高级结构变优点：具有不破坏酶活性中心和酶高级结构变化少，若能找到适当的载体，这是简单的好方法。化少，若能找到适当的载体，这是简单的好方法。 缺点：酶与载体结合力弱、酶易脱落等。缺点：酶与载体结合力弱、酶易脱落等。 酶工程原理及其在食品工业中的应用 （2 2）离子吸附法。通过离子

46、效应，将酶分子固）离子吸附法。通过离子效应，将酶分子固定到含有离子交换基团的固相载体上。定到含有离子交换基团的固相载体上。 常见的载体：常见的载体：DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、 DEAE-DEAE-葡聚糖凝葡聚糖凝胶、胶、CM-CM-纤维素、纤维素、DOWEX-50DOWEX-50等。等。 优点：操作简单，处理条件温和，能得到酶活优点：操作简单，处理条件温和，能得到酶活回收率较高的固定化酶。回收率较高的固定化酶。 缺点：酶与载体的结合力较弱，当离子强度高、缺点：酶与载体的结合力较弱，当离子强度高、缓冲液种类或缓冲液种类或pHpH值发生变化时，酶容易脱落。值发生变化时，酶容易脱落。 酶工

47、程原理及其在食品工业中的应用 2.2.化学结合法化学结合法 （1 1）共价结合法。将载体有关基团活化、与）共价结合法。将载体有关基团活化、与酶分子上的功能团发生化学反应形成共价键的一酶分子上的功能团发生化学反应形成共价键的一种固定化方法，是研究得最多的固定化方法之一。种固定化方法，是研究得最多的固定化方法之一。 可与载体结合的酶的功能团：可与载体结合的酶的功能团：或或-NH2-NH2，、或或-羧基，巯基，咪唑基，酚基等，但参羧基，巯基，咪唑基，酚基等，但参与共价结合的氨基酸残基应当是酶催化活性的非与共价结合的氨基酸残基应当是酶催化活性的非必需基因，否则可能会导致固定后酶活力完全丧必需基因，否则

48、可能会导致固定后酶活力完全丧失。失。 特点：反应条件苛刻，操作复杂，容易使酶特点：反应条件苛刻，操作复杂，容易使酶的高级结构发生变化而破坏活性中心，操作时需的高级结构发生变化而破坏活性中心，操作时需注意。注意。 酶工程原理及其在食品工业中的应用 （2 2）共价交联法。通过双功能或多功）共价交联法。通过双功能或多功能试剂（交联剂），在酶分子之间或酶分子能试剂（交联剂），在酶分子之间或酶分子与微生物细胞之间形成共价键的连接方法。与微生物细胞之间形成共价键的连接方法。它与共价结合法的区别是它使用交联剂而不它与共价结合法的区别是它使用交联剂而不用载体。用载体。 常用的交联剂：戊二醛、异氰酸酯、顺常用的

49、交联剂：戊二醛、异氰酸酯、顺丁烯二酸酐和乙烯共聚物等。丁烯二酸酐和乙烯共聚物等。 特点：反应条件比较激烈，固定化酶的特点：反应条件比较激烈，固定化酶的活力回收率较低，但尽量降低交联剂浓度和活力回收率较低，但尽量降低交联剂浓度和缩短反应时间，会有助于固定化酶比活力的缩短反应时间，会有助于固定化酶比活力的提高。提高。 酶工程原理及其在食品工业中的应用 3.3.包埋法包埋法 可分为凝胶网格型和微囊型。将酶或微生物可分为凝胶网格型和微囊型。将酶或微生物包埋在高分子凝胶网格中的包埋法称为凝胶网格包埋在高分子凝胶网格中的包埋法称为凝胶网格包埋型，将其包埋在高分子半透膜中的包埋法称包埋型，将其包埋在高分子半

50、透膜中的包埋法称为微囊型。为微囊型。 优点：一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基起优点：一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基起结合反应，较少改变酶的高级结构，酶活力的回结合反应，较少改变酶的高级结构，酶活力的回收率较高。收率较高。 缺点：仅适用于小分子底物和产物的酶，因缺点：仅适用于小分子底物和产物的酶，因为只有小分子物质才能扩散进入高分子凝胶的网为只有小分子物质才能扩散进入高分子凝胶的网格，并且这种扩散阻力还会导致固定化酶动力学格，并且这种扩散阻力还会导致固定化酶动力学行为的改变和酶活力的降低。行为的改变和酶活力的降低。 酶工程原理及其在食品工业中的应用 （1 1）凝胶网格型。采用明胶、卡拉胶、）凝胶网

51、格型。采用明胶、卡拉胶、海藻酸钠或淀粉等天然高分子化合物作为海藻酸钠或淀粉等天然高分子化合物作为包埋剂时，可以将酶直接与溶胶态的包埋包埋剂时，可以将酶直接与溶胶态的包埋剂混合凝胶化。剂混合凝胶化。 缺点：凝胶孔径不规则，有一部分大缺点：凝胶孔径不规则，有一部分大于平均孔径，时间稍长时，酶容易泄漏。于平均孔径，时间稍长时，酶容易泄漏。常与交联法结合达到加固的目的，如先用常与交联法结合达到加固的目的，如先用明胶包埋，再用戊二醛交联等。明胶包埋，再用戊二醛交联等。 酶工程原理及其在食品工业中的应用 （2 2）微囊型。利用各种类型的膜将酶）微囊型。利用各种类型的膜将酶封闭起来，这类膜能使小分子产物和底

52、物封闭起来，这类膜能使小分子产物和底物通过，而酶和其他的高分子不能通过。通过，而酶和其他的高分子不能通过。 缺点：反应条件要求高，制备成本高。缺点：反应条件要求高，制备成本高。 酶工程原理及其在食品工业中的应用酶工程原理及其在食品工业中的应用（二）细胞的固定化方法（二）细胞的固定化方法 细胞固定化的主要方法有用载体对细胞细胞固定化的主要方法有用载体对细胞的包埋法和利用载体与细胞之间吸引力的吸的包埋法和利用载体与细胞之间吸引力的吸附法两种。固定化细胞的制备方法类似于固附法两种。固定化细胞的制备方法类似于固定化酶的制备方法。定化酶的制备方法。 优点：固定化后酶活基本没有损失，它优点：固定化后酶活基

53、本没有损失，它还保留了细胞原有的多酶系统，对于多步催还保留了细胞原有的多酶系统，对于多步催化转换的反应，优势更加明显，而且勿需辅化转换的反应，优势更加明显，而且勿需辅酶的产生，直接将微生物细胞固定化，不仅酶的产生，直接将微生物细胞固定化，不仅可以免去提纯酶的步骤。可以免去提纯酶的步骤。 酶工程原理及其在食品工业中的应用 缺点：只适用于胞内酶，而且细胞中的缺点：只适用于胞内酶，而且细胞中的酶很多，可能产生副反应，使产物不纯。在酶很多，可能产生副反应，使产物不纯。在选用固定化细胞作为催化剂时，应考虑到底选用固定化细胞作为催化剂时，应考虑到底物和产物是否容易通过细胞膜，膜内是否存物和产物是否容易通过

54、细胞膜，膜内是否存在产物分解系统和其他副反应系统，或者说在产物分解系统和其他副反应系统，或者说虽有这两种系统，但是否可事先用热处理或虽有这两种系统，但是否可事先用热处理或pHpH值调整等简单方法使之失效。值调整等简单方法使之失效。酶工程原理及其在食品工业中的应用（三）固定化酶（细胞）的性质（三）固定化酶（细胞）的性质 1.1.酶活力的变化酶活力的变化 酶经固定化后，酶分子的构象可能改酶经固定化后，酶分子的构象可能改变，导致了酶与底物结合能力或催化底物变，导致了酶与底物结合能力或催化底物转化能力发生变化；载体的存在给酶的活转化能力发生变化；载体的存在给酶的活性部位或调节部位造成某种空间障碍，影性

55、部位或调节部位造成某种空间障碍，影响酶与底物的作用；酶包埋于载体，底物响酶与底物的作用；酶包埋于载体，底物必须扩散进入载体才能和酶分子接触，扩必须扩散进入载体才能和酶分子接触，扩散速率的不同限制了酶与底物的作用。散速率的不同限制了酶与底物的作用。酶工程原理及其在食品工业中的应用 2.2.酶稳定性的变化酶稳定性的变化 经固定化后，大多数酶的稳定性提高，经固定化后，大多数酶的稳定性提高，这对实际应用十分有利。固定化酶的稳定性这对实际应用十分有利。固定化酶的稳定性常用半衰期（常用半衰期（t1/2t1/2）表示，即固定化酶活力）表示，即固定化酶活力降为最初活力一半所经历的连续工作时间。降为最初活力一半

56、所经历的连续工作时间。它是衡量固定化酶操作稳定性的关键。它是衡量固定化酶操作稳定性的关键。 3.3.最适最适pHpH值的变化值的变化 氢离子在溶液和固定化酶之间的分配效氢离子在溶液和固定化酶之间的分配效应，对反应速度具有重要影响。如果酶反应应，对反应速度具有重要影响。如果酶反应产生酸或消耗酸时，产生酸或消耗酸时，pHpH值曲线会发生显著变值曲线会发生显著变化（曲线向右移动或向左移动），最适化（曲线向右移动或向左移动），最适pHpH值值也会相应变化。也会相应变化。酶工程原理及其在食品工业中的应用 4.4.最适温度的变化最适温度的变化 酶反应的最适温度是酶失活速度与酶酶反应的最适温度是酶失活速度与

57、酶反应速度综合的结果。在一般情况下，固反应速度综合的结果。在一般情况下，固定化后酶的失活速度下降，最适温度也随定化后酶的失活速度下降，最适温度也随之提高。之提高。 5.5.动力学常数的变化动力学常数的变化 酶固定于电中性载体后，表观米氏常酶固定于电中性载体后，表观米氏常数往往比游离酶的米氏常数高，而最大反数往往比游离酶的米氏常数高，而最大反应速度变小；而当底物与带有相反电荷的应速度变小；而当底物与带有相反电荷的载体结合后，表观米氏常数往往减小，这载体结合后，表观米氏常数往往减小，这对固定化酶实际应用有利。此外，在高离对固定化酶实际应用有利。此外，在高离子强度下，酶的动力学常数几乎不变。子强度下

58、，酶的动力学常数几乎不变。 酶工程原理及其在食品工业中的应用（四）固定化酶（细胞）的评价（四）固定化酶（细胞）的评价指标指标 1.1.相对酶活力相对酶活力 具有相同重量酶蛋白的固定化酶与游离具有相同重量酶蛋白的固定化酶与游离酶活力的比值。它与载体结构、颗粒大小、酶活力的比值。它与载体结构、颗粒大小、底物相对分子质量及酶的结合效率有关。相底物相对分子质量及酶的结合效率有关。相对酶活力低于对酶活力低于75%75%的固定化酶，一般无实际应的固定化酶，一般无实际应用价值。用价值。 2.2.酶的活力回收率酶的活力回收率 固定化酶的总活力与用于固定化的酶总固定化酶的总活力与用于固定化的酶总活力的百分比。一

59、般情况下，活力回收率应活力的百分比。一般情况下，活力回收率应小于小于l l。酶工程原理及其在食品工业中的应用（五）固定化酶的优缺点（五）固定化酶的优缺点 优点：优点：极易将产物和底物分开；可以在极易将产物和底物分开；可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；在大多数情况下，可以提高酶的稳定性；应；在大多数情况下，可以提高酶的稳定性；酶反应过程可以严格控制；产物中没有酶的酶反应过程可以严格控制；产物中没有酶的残留，简化了工业设备；较水溶性酶更适合残留，简化了工业设备；较水溶性酶更适合于多酶反应；可以增加产物的收得率，提高于多酶反应；可以增加产物的收得率

60、，提高产物的质量；酶使用效率提高，成本降低。产物的质量；酶使用效率提高，成本降低。 酶工程原理及其在食品工业中的应用缺点：缺点：固定化时，酶活力有损失；增加了固定化时，酶活力有损失；增加了固定化的成本，工厂投资开始增大；只固定化的成本，工厂投资开始增大；只能用于水溶性底物，而且较适用于小分能用于水溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜；与完整子底物，对大分子底物不适宜；与完整菌体相比，不适合多酶反应，特别是需菌体相比，不适合多酶反应，特别是需要辅助因子的反应；胞内酶必须经过酶要辅助因子的反应；胞内酶必须经过酶的分离过程。的分离过程。酶工程原理及其在食品工业中的应用七、酶反应器七、