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1、实验三实验三 革兰氏染色法革兰氏染色法一、目的与要求：1、了解革兰氏染色法原理。2、学习并掌握油镜的使用。3、学习判断微生物染色法技术，微生物革兰氏反应。革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（ G- ）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法（KOH溶解试验和氨基肽酶试验可用作辅助试验）。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的

2、结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色2、流程路线：、流程路线：涂片涂片 干燥干燥 固定固定 草酸铵结晶紫草酸铵结晶紫染色染色1min 水洗干燥水洗干燥 碘液媒碘液媒1min水洗干燥水洗干燥 95%乙醇脱色乙醇脱色 1520s 水洗干燥水洗干燥 番红复染番红复染1min 水洗干燥水洗干燥 镜鉴镜鉴 1、菌株：大肠杆菌（Escherichia coli ）；金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Rosenbach

3、） (1)涂片 干燥 固定:21（2）草酸铵结晶紫染色1min 水洗干燥 （3）碘液媒染1min 水洗 干燥（4）95%乙醇脱色1520秒 水洗 干燥（5）番红复染1min 水洗 干燥 镜检油镜镜检一般是经低倍、高倍到油镜低倍寻找到目标物后,把镜头转成八字形后,玻片上加油，转到油镜,从侧面观察，将油浸镜下移到与玻片稍微接触为止，然后用微调向上提升调准焦点，到看清物像为止。并绘出形态图。观察完毕，上旋镜筒，取出标本片之后，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后沾取少许二甲苯。擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。勿用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦镜显微镜的机械部分将各部分还原，反光镜垂直于镜座、将物镜转成八字形在向下旋，同时把聚光镜降下，才可以镜入镜箱内。 五、注意事项：（1）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀，固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。（2）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱色时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不足，革兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。（3）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应为准。（4）选用培养16-24 h菌龄的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。大肠杆菌1000倍金黄色葡萄球

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