剪切应力特性对血管内膜增生及动脉粥样斑块形成的影响1

1、剪切应力特性对血管内膜增生及动脉粥样斑块形成的影响 1摘要：目的 设计局部狭窄而导致血流动力学改变的实验模型，探讨剪切应力对血 管内膜增生以及动脉粥样硬化斑块形成的影响。方法 兔颈总动脉平直段套环形 成狭窄度为 40%的局部狭窄，分别饲以正常饮食以及高脂高胆固醇饮食 4 周； 数值计算的方法模拟血流流场和剪切应力分布及其特征；氧化酶法测定血浆总 胆固醇、甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇的浓度； HE染色检测颈总动脉病理改 变； Verhoeff 法染色观察血管弹力纤维分布；油红 O染色观察斑块内的脂质沉 积； HPLC检测血管壁脂质含量。结果 套环形成局部狭窄后，颈总动脉血流流 场发生显著的扰动，

2、狭窄远心端有涡流以及二次流形成；狭窄近心端形成局部 高剪切应力区域，而在远心端形成振荡的低剪切应力区域。 4 周后，高脂高胆 固醇组空腹血浆总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平升高，普通饮食组血 脂水平没有明显改变， HE染色显示普通饮食组和高脂高胆固醇饮食组颈总动脉 狭窄的近心端和远心端均有明显的内膜增生以及动脉粥样硬化斑块形成，近心 端比远心端病变更严重，并且近心端增生内膜的细胞成分主要为圆形的泡沫细 胞而远心端增生内膜的细胞成分主要为梭形平滑肌细胞； Verhoeff 染色显示病 变处弹力纤维排列紊乱，部分内弹力板断裂；油红 O染色发现增生的内膜中有 大量的脂质沉积； HPLC检测也表明

3、狭窄近心端以及远心端血管段胆固醇含量明 显增加。结论高剪切应力以及低振荡剪切应力均引发动脉粥样硬化病变的形成， 高剪切应力诱导不稳定性斑块的形成，低振荡剪切应力诱发稳定性斑块的形成。关键词：剪切应力，颈总动脉，狭窄，动脉粥样硬化学科分类号： Q71研究表明动脉粥样硬化总是发生在动脉的弯曲、分叉及狭窄部位，如主动 脉弓、颈动脉分支、冠状动脉、腹主动脉分支和股动脉分支等特殊部位，学术 界称此现象为动脉粥样硬化的局灶性。研究表明，血流动力学因素对动脉粥样 硬化局灶性起着非常重要的作用，而流动产生的剪切应力是其中的关键因素。 研究认为剪切应力改变可以使内膜局部受损并促进斑块形成， Fry 等1 认为高

4、 剪切应力损伤内膜促进动脉粥样硬化的发生发展，而 Cao等2 认为低剪切应力 是诱导动脉粥样硬化斑块形成的主要原因。由于 Fry 所推测的损伤内皮细胞层 的切应力水平远在正常生理水平之上，因此很多学者对高切应力学说持否定态 度，但单纯的低剪切应力还不足以充分解释动脉粥样硬化斑块自出现后同时有 颈向及下游轴向发展的趋势 3 。为了进一步探讨不同剪切应力对动脉粥样硬化 发生发展的影响，本文采用外科手术的方法，在兔的左颈总动脉套环作一狭窄 度为 40%的局部狭窄，改变狭窄的远心端和近心端局部剪切应力，并以右颈总 动脉作为对照，探讨剪切应力特性对动脉粥样硬化病变形成和发展的影响。1. 材料和方法1.1

5、 颈总动脉局部狭窄动物模型的建立参考 Cheng C等方法4 ，简述如下：腹腔注射戊巴比妥钠溶液，麻醉；头 颈拉直，充分暴露颈部；除毛，络合碘涂布法消毒，铺设无菌孔巾；沿颈部正 中线从甲状软骨与胸骨之间剪开皮肤，纵向钝性分离颈部肌群，暴露出气管。 找到气管两侧的颈动脉鞘，用玻璃分针细心剥离鞘膜，分离出左、右侧颈总动 脉；将硅胶管套于左侧颈总动脉上，手术线固定套环，喂养 4 周。1.2 局部狭窄血管流场的数值模拟1.2.1 局部狭窄血管的几何模型：数值模拟所用动脉狭窄几何模型如图 1 所示，该狭窄血管段为一轴对称圆 管，管径为 0.15cm，与兔颈总动脉直径相当。 r 为狭窄段血管内径， R为平

6、直 段血管内径，以（ R-r ）/R代表狭窄程度， L2为0.8cm，L1为5cm。1.2.2 控制方程和边界条件 假定血管壁为刚性，血液为不可压缩的牛顿流体，粘度 为 3.5mPa s， 血液密度 =1.05×103 Kg/m3。在这些假设条件下，定常流的 Navier-Stoke 方程为：1.2.3 数值求解数值求解通过 fluent 软件来实现1.2.3.1 建立模型及网格划分通过 GAMBIT软件建立如图 2 所示狭窄率为 40%的三维狭窄血管模型，血管 入口直径取 0.15cm，狭窄两端长度均为 5cm。对模型进行网格划分，划分结果 为 13390 个单元，以1.2.3.2

7、 设定边界条件将网格划分后的图形导入 Fluent 软件中；检查网格的划分；选择求解器 （3D） 。选用求解模型，设定初始变量。1.2.3.3 后处理 设定好初始变量后，开始迭代求解。求解后，我们获取的结果包括血管内 的流场分布、血管壁面剪切力。1.3 血脂的测定在手术前和手术后第 4 周，耳缘静脉采血，不抗凝。化学法测定血清中总 胆固醇 （TC） 、甘油三脂（ TG）、高密度脂蛋白胆固醇（ HDL-C）， Friedwald 公 式计算低密度脂蛋白胆固醇（ LDL-C），公式为 LDL-C=TCHDL-C TG/2。1.4 主动脉脂质条纹染色戊巴比妥钠麻醉，髂动脉插管放血法处死动物，取出整条

8、主动脉（从主动 脉弓至髂动脉分支下），清除外部的脂肪和结缔组织后用生理盐水将血管冲洗 干净， 10福尔马林液固定，然后沿动脉纵向剪开， 37浸泡于 5g/L 苏丹与 70%的异丙醇配置的混合液中 15min，70的异丙醇冲洗 3 次，平铺照相。1.5 颈总动脉病理学观察将 10%中性福尔马林固定的颈总动脉经蒸馏水冲洗 0.5-1 h ， 70%酒精浸泡 24h，80%酒精浸泡 24h，95%酒精浸泡 30min，95%酒精 30min，100%酒精 浸泡 30min，100%酒精浸泡 30min，100%酒精与二甲苯混合液（ 1:1 ）浸泡 20min，二甲苯浸泡 20min，二甲苯浸泡 20

9、min，软蜡浸泡 10min，硬蜡浸 泡 10min，包埋制成石蜡块，连续切片（厚度为 5 m），摊片， 60烤片 1h， 切片常规脱蜡入水， HE染色，光学显微镜下观察动脉粥样硬化斑块病变情况。1.6 油红 O染色检测颈总动脉斑块内脂质蓄积 5将组织用 4%甲醛固定 24h，水洗 5min，冰冻切片。 60异丙醇中放置 5min， 用新过滤的油红 O（储备液含 0.5 油红 O、98异丙醇，使用前用水稀释至 50， 24h 后过滤）染色 10min，60异丙醇分化 5min，水洗 5min，苏木素染 色 5min ，水洗返兰，水性封片剂封片，显微镜下观察。1.7 血管壁胆固醇含量的测定取血管

10、，于冰上研磨，匀浆，取 100l 研磨液 Lorry 法测定蛋白质含量。 研磨液加入等体积新鲜配制的 15醇溶性氢氧化钾（ 20保存），震荡至溶 解产物清亮，加入一定量 6三氯乙酸去除其中的蛋白质成分，加入等体积的 正己烷异丙醇（两者溶液的体积比为 4:1 ），震荡 5min，15000rpm，4，离 心 5min ，收集上层有机相，将下层水相按上述方法反复抽提两次，收集上层有 机相， 65真空冷冻干燥 90min。室温冷却后加入 0.1ml 的流动相，震荡使之 溶解，超声除气 5min，15000 rpm，4，离心 5min，收集上清液。参考王佐等 6 的高效液相色谱法 （high perf

11、ormance liquid chromatography, HPLC）测定胆固醇含量。具体操作如下：取 5l 样品进样， C4反相柱，以异丙醇：正庚 烷：乙腈为流动相，非梯度洗脱， 1ml/min ，柱温 40，检测波长 216nm，检测 到第 8min, 单位为 g/g 蛋白。1.8 统计学处理实验数据用平均数±标准差 （x ±S）表示。采用 SPSS10.0统计软件进行单因 素方差分析，两两均数间的多重比较，采用 Student t 检验， P<0.05 为差异达 到显著水平。2. 结果2.1 局部狭窄血管流场分布由图 3 可知，当入口流速不太大时，狭窄下游存在

12、强度很小的涡流。上游 无狭窄段流场基本保持不变，直到狭窄入口处流场迅速改变；在狭窄远心端的 流场明显发生改变，流场变得紊乱，有涡流形成。随着流速的增大，狭窄远心 端的涡流强度也随之增大，并且流场也变得更为复杂。2.2 局部狭窄血管的剪切应力分布图 4 为数值计算所得壁面剪切应力的分布。壁面剪切应力在狭窄处的近前 部稍微降低，然后突然升高达到峰值，随后急剧下降，但仍维持较高的剪切应 力值。在狭窄的远心端壁面剪切应力迅速下降，直到接近于零，尔后又回升， 逐步回复到无扰动层流值，形成一振荡性的低剪切应力区域。2.3 饮食对血脂的影响实验动物在高脂高胆固醇喂养 4 周后， TC迅速升高，高脂高胆固醇饲

13、料组 与普通饲料组相比差异显著，而普通饲料组在整个实验过程中TC变化很小，在高脂高胆固醇饲料喂养 4 周后， LDLC、TG也明显升高，与普通饲料组相比差异 达显著水平。而 HDLC虽然略有升高，但差异不显著。2.4 主动脉脂质条纹染色在高脂高胆固醇组动物的主动脉明显可见动脉粥样硬化斑块和脂质条纹， 在主动脉弓弯曲处以及腹主动脉的血管分岔处这样的几何形状急剧改变的区域 病变特别明显，图像分析软件分析结果表明高脂高胆固醇饮食组主动脉病变区 占整个主动脉面积的( 27.6 ±7.8 )，而普通饮食组主动脉无脂质条纹病变 见图 5 所示。2.5 剪切应力对颈总动脉病理形态的影响结果显示，

14、4 周后，普通饮食组和高脂高胆固醇饮食组未套环的对照侧血 管内膜完整，中膜含有大量梭形平滑肌细胞，在血流动力学改变的狭窄近心端 以及远心端均有明显的内膜增生，近心端增生内膜内存在大量圆形空泡样的泡 沫细胞，远心端增生的内膜主要为平滑肌细胞。高脂高胆固醇饮食组与正常饮 食组病理形态基本一致，但病变更为严重，在狭窄的近心端有明显的复合斑块 形成。(如图 6)2.6 弹力纤维的改变4 周后，狭窄近心端、狭窄段以及狭窄远心端的弹力纤维发生明显的改变， 表现为近心端弹力纤维排列紊乱，内弹力板断裂，高脂高胆固醇饮食组更为明 显，远心端弹力纤维紊乱，但内弹力板完整。而普通饮食组和高脂高胆固醇组 对照侧血管的

15、内弹力板完整，排列有序。2.7 颈总动脉血管壁脂质蓄积如图 8 所示，油红 O染色可见狭窄近心端、狭窄段以及狭窄远心端均有染 成红色的大量脂滴，而右侧对照组未见红染的脂滴。狭窄近心端脂质主要沉积 于增生内膜，而远心端的脂质沉积主要位于血管的中膜。相对于狭窄的远心端，狭窄近心端的脂滴更多，更大2.8 颈总动脉血管壁胆固醇含量 颈总动脉狭窄后，普通饮食组和高脂高胆固醇饮食组狭窄近心端和远心端 血管壁胆固醇含量均上升，普通饲料组狭窄近心端为 7.6 ±2.1 mg/g ，远心端 胆固醇含量为 5.6 ±1.8 mg/g ，而对照侧仅为 1.3 ±0.5 mg/g ；高脂

16、高胆固醇饲 料组胆固醇含量更高，狭窄近心端为 12.7 ±3.1 mg/g ，远心端为 8.7 ±1.9 mg/g，而对侧对照组仅为 1.5 ±0.4 mg/g ，与对侧对照相比，差异具有显著性 （P<0.05）。3. 讨论血流动力学与心血管疾病特别是动脉粥样硬化关系密切，血液在血管中流 动对血管壁产生流动剪切力、周向应力和压应力，其中流动剪切应力在心血管 系统的病理和生理中起着非常重要的作用 7-9 。研究表明，血管壁切应力的减 低和增大，血流形态异常如非层流状态、湍流、边界层血流分离等血流动力学 因素均可能与动脉粥样硬化密切相关 10 。Depaola

17、等11 认为较大的剪切力 梯度能诱导内皮细胞功能的改变，从而有可能导致内膜增生的形成。 Tardy 等 12 人发现动脉易损部位与该处的剪切力梯度有着密切关系，认为剪切力梯度 对内皮层血管重构起着重要作用。 Dirksen13 通过对尸解的 33 个颈动脉斑块 的研究结果表明，在下游区 67的斑块含有较多的平滑肌细胞，在上游区 67 的斑块有较多的巨噬细胞， 9 个破裂的斑块 6 个发生在上游区，上游和下游斑 块中细胞成分的差异提示了血流动力学在其中的作用。邓小燕等 14 采用数值计算的方法探讨了狭窄度分别为 30%、40%、50%以 及 60%的狭窄对动脉粥样硬化形成和发展的影响，认为当狭窄

18、度小于40%时，狭窄度的增加促进动脉粥样硬化的发展，当狭窄度大于 40%时，随着狭窄度的增 加可能抑制动脉粥样硬化进程。为了进一步探讨剪切应力对血管内膜增生和动 脉粥样硬化的影响，我们采用外科手术的方法，在兔的左颈总动脉处套环作一 狭窄度为 40%的局部狭窄，使该处的血流流场发生改变，而改变局部的血管壁 的剪切应力，探讨血管内膜增生和动脉粥样病变的血流动力学机制。我们的数值模拟结果表明，兔颈总动脉套环形成局部狭窄，血液流动在狭 窄处受到严重干扰，在狭窄的近心端和远心端发生明显的切应力异常。壁面剪 切应力在狭窄处的近心端稍微降低，然后突然升高达到峰值，在狭窄段入口处 急剧下降，但依然明显高于平直

19、段血管壁的剪切应力值。在狭窄的远心端剪切 应力迅速下降，达到接近于零，尔后又缓慢回升，逐步回复到无扰动层流的值。 在实验中我们发现不管是正常饮食组还是高脂高胆固醇饮食组狭窄的近心端和 远心端都有明显的内膜增生和动脉粥样硬化斑块形成，病变部位主要是大量增 殖的平滑肌细胞、泡沫细胞和以胶原纤维为主的结缔组织。 HE染色结果表明狭 窄的近心端病变远较狭窄远心端严重，并且狭窄近心端动脉粥样硬化斑块含有 大量泡沫细胞，而狭窄远心端主要为平滑肌细胞的增生，近心端显著增加的泡 沫细胞和脂质显示了高的切应力与斑块的不稳定性之间的关系，远心端大量的 增生的平滑肌细胞则显示了振荡的低剪切应力提供斑块进行性增长的背景。在实验中油红 O染色和高效液相色谱检测表明不管在正常饮食组还是普通 饮食组在狭窄的近心端还是远心端的动脉粥样硬化性病变处均有大量的脂质沉 积。由于狭窄近心端为高剪切应力区域， Fry 认为