动物对长角血蜱幼虫感染的免疫应答.

1、动物对长角血蜱幼虫感染的免疫应答动物对长角血蜱幼虫感染的免疫应答寄生虫与医学昆虫学报 2000 年第 1期第 7卷 著 述作者：赵忠芳 孔繁瑶 杨汉春 纪炳纯单位：赵忠芳（南开大学生物系，天津， 300071）；孔繁瑶（中国农业大学， 北京， 100094）；杨汉春（中国农业大学，北京， 100094）；纪炳纯（南开大 学生物系，天津， 300071）关键词：长角血蜱；动物；免疫应答摘要 长角血蜱 （Haemaphysalis longicornis） 幼虫长时间感染 Wistar 大 鼠后，其细胞免疫和体液免疫均被抑制。兔在长角血蜱幼虫第 2 次感染 24h 后，引起蜱叮咬处皮肤嗜酸性粒细胞

2、聚集，表现为超敏反应。IMMUNE RESPONSE OF ANIMALS INDUCED BY LARVALHAEMAPHYSALIS LONGICORNIS TICKSZhao ZhongfangDepartment of Biology,Nankai University,Tianjin 300071 )Kong FanyaoChina Agricultural University,Beijing 100094 )Yang HanchunChina Agricultural University,Beijing 100094 )Ji BingchunDepartment of Biol

3、ogy,Nankai University,Tianjin 300071Abstract The cell-mediated and humoral immunity of Wistar rats was suppressed,these rats had been infested with larvae of H.longicornis for a long time.Immune response of rabbits to larvae of Haemaphysalis longicornis 24 hours after the second infestation revealed

4、 cutaneous hypersensitivity reaction characterized by local cutaneous eosinophilia.Key words Haemaphysais longicomis Animals Immune response长角血蜱 (Haemaphysalis longicornis) 在我国分布较广，它的宿主种类广 泛，包括牛、马、羊等家畜和鹿、熊、狐、兔等野生动物。它不仅自身作为病 原体侵袭动物及人，还可以作为媒介传播多种病原体。通过对蜱叮咬处进行的 组织学和组织病理学分析，可以了解到参与免疫反应的炎性细胞，但不同种蜱 感染不同种动

5、物所得结论不尽相同。 Riek(1962) 观察到对微小牛蜱 (Boophilus microplus) 有抵抗力的牛在蜱叮咬处聚积着淋巴细胞和多形核细胞，主要以嗜 酸性粒细胞为主； Allen 等(1997) 报道，黄牛对全环硬蜱 (Ixodes holocyclus) 的再感染是由嗜碱性粒细胞引起的皮肤 过敏 反应：而 Tatchell 和 Moorhouse(1970)对狗感染血红扇头蜱 (Rhipicephalus sanguineus) 的研究，认 为蜱叮咬处皮肤的浸润细胞是嗜中性粒细胞。本实验用长角血蜱幼虫感染兔， 来探讨这一问题。 Inokuma 等(1994) 测得长角血蜱唾液

6、腺内含前列腺素 E2，它 能抑制宿主对蜱叮咬的炎性反应 (Ribeiro et al.,1985)。但长角血蜱幼虫长时间叮咬对宿主免疫功能会有什么影响呢 ?本研究对此做了初步的探讨。1 材料与方法1.1 实验用蜱长角血蜱饱血雌虫采自北京市房山区蒲洼乡义和村山羊体表，在实验室内 产卵，并孵化出幼虫。1.2 德国大耳白兔德国大耳白兔购于中国农业大学动物科技学院兔场，雄性，每只体重在2.3kg 2.6kg 之间，共 5只，感染组 3只，对照组 2只。每只兔背部皮肤第 1 次感染 500只饥饿幼虫，间隔 33d后进行第 2 次感染，每只兔背部皮肤感染 300 只幼虫，对照组不感染。在第 2 次叮咬后的

7、 24h取材，每只兔取蜱聚集叮 咬处的 15mm×15mm× 2mm两块皮肤，中性甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切 片（横切），厚 6m，用苏木素伊红和瑞氏染色。1.3 Wistar 雄性大鼠购于北京医科大学实验动物部，每只体重 250g 300g，分两组，即感染组 和对照组，每组 4 只，感染组，每只鼠背部感染约 150 只幼蜱，任蜱自行叮 咬。蜱首次叮咬后 12h，对感染组和对照组进行弗氏完全佐剂牛血清白蛋白免 疫（3mg/只），间隔 7d 进行二免，剂量仍为 3mg/只。 1 次 6次感染在 4/5 蜱饱 血后进行下一次感染。第 6 次饱血后，间隔 7d 进行第 7

8、次感染，第 7 次幼虫饱 血后进行心脏采血，进行 ELISA 和淋转实验。第 1 次采血后间隔 7d，进行第 8 次感染，在幼虫全部饱血后进行第 2 次心脏采血，进行 ELISA 和淋转实验。1.4 淋巴细胞转化试验用 24 孔培养板全血细胞培养， 3H- 胸腺嘧啶核苷 （ 3H-TdR）掺入法 （ 杨汉春， 1996） 。两批实验 ConA的最终浓度分别为 10g/mL和 8g/mL每份样品设 2 个 复孔。置 37， 5%CO2培养箱 54h后，加 3H-TdR 2ci/ 孔，继续培养至 72h， 培养过程中，每天用微量振荡器振荡 2 次，每次 30s。培养结束后，取出培养 板，将孔内液体

9、分别移入离心管中，并用 2mL生理盐水分 3 次洗入离心管， 3 000r/min ，离心 5min，弃上清液，向沉淀每管加 3mL蒸溜水，振摇 40s，使红细胞裂解，加入 3.6%氯化钠溶液 1mL，3 000r/min ，离心 10min，弃上清，沉 淀细胞加生理盐水 6mL，洗 2 次。末次沉淀细胞加入 10%的三氯乙酸溶液 2mL， 1 500r/min ，离心 10min，弃上清液，重复 2 次；向沉淀每管加入 30%H2O2 1 滴，再向每管加入 0.5mL 浓甲酸，然后置入 85烘箱中烘至体积小于 0.1mL； 用 5mL水溶性闪烁液分 3 次洗入闪烁杯中，充分摇匀乳化；放入 M

10、INAXI B Tri-carb 4 000 series liquid Scintillation counter,测定计算每分钟衰变数 （DPM），计算出刺激指数 （SI） ，求其均值。1.5 ELISA 法测大鼠血清效价应用常规 ELISA 测牛血清白蛋白效价。通过预试验确定牛血清白蛋白的包 被浓度为 3g/mL,鼠血清与 HRP（辣根过氧化物酶 ）标记羊抗鼠 1gG均 37作用 1.5h。2 结果除空白对照组外 （图版 -1） ，所有感染兔均表现皮肤过敏和炎症反应 （图版 -2） ，蜱叮咬处皮肤表皮和真皮浅层交界处积聚大量嗜酸性粒细胞 （ 图版- 3） ，形成“ cuff ”结构，即在

11、蜱的口器周围积聚多层嗜酸性粒细胞 （图版-4） ，偶有数量不多的嗜碱性粒细胞出现，同时伴有单核细胞浸润，胞质脱落的 细胞也较多。蜱叮咬处的表皮也出现皮肤反应，表现为细胞坏死及紧邻的细胞 肿胀，有的出现空泡变性，胞核淡染。真皮浅层毛细血管内炎性细胞较多，有 充血及出血现象。1 未感染长角血蜱幼虫的兔皮肤组织切片（苏木素伊红染色， 164×）Eosin staining,164 ×)1 Unexposed to Haemaphysalis longicornis larvae skinhistological section (Haematoidin-2 感染长角血蜱幼虫的兔皮

12、肤有损伤和炎症反应，其附近有一虫体（苏木素伊红染色， 41×）2 Exposed to Haemaphysalis longicornis larvae skin,the picture showed the damageand inflammation,there is a larva near the wound(Haematoidin- Eosin staining, 41 ×)410×)3 感染长角血蜱幼虫部位嗜酸性粒细胞浸润（苏木素伊红染色，Eosin staining,410 ×)3 Exposed to Haemaphysalis long

13、icornis larvae skin,eosinophil infiltration(Haematoidin-4 感染长角血蜱幼虫部位嗜酸性粒细胞积聚 , 形成“ cuff ”结构（瑞氏染色，164×）4 Exposed to Haemaphysalis longicornis larvae skin,eosinophil building up a“cuff ”structure(Wrightstaining,164 ×)2.1 幼虫感染大鼠细胞免疫的影响Wistar 大鼠在受到长角血蜱幼虫感染 7 次和 8次后，外周血 ConA诱导 T 淋巴细胞转化的刺激指数都低于相

14、应的对照组。经 t 检验，第 7 次感染，差异 显著 P<0.05 ；第 8次感染差异极显著， P< 0.01 。表明长角血蜱幼虫感染使得 大鼠 T 细胞转化能力下降。详见表 1。表1 鼠 T细胞对 ConA应答的增殖反应Tab.1 ConA proliferation response of T cells in rats处理TreatmentSI 平均值± SDAverage of SI ± SD感染组 Infection8.7 ±1.118.2 ±2.4(b)对照组 Control13.3 ±3.3 *39.3 ±3

15、.4 *注：*为第 7次感染(7th infection) ，差异显著； *为第 8次感染(8th infection) ，差异极显著 2.2 幼虫感染对大鼠体液免疫的影响鼠血清以 1：800 开始做 2 倍比稀释， HRP标记的绵羊抗鼠 IgG 以 1：1 000 稀释。阴性血清为未感染未免疫大鼠血清，稀释度都为 1：670。从表 2 中可以 看出：感染组和对照组相比，大鼠血清效价有所下降。表 2 ELISA 法测得大鼠血清效价Table 2 Serum titer of rats detected by ELISA组别Groups大鼠数量Number of rats血清效价Serum ti

16、ter感染组 Infection41:25600（3 只）-1 ：102400（1 只）对照组 Control41：102400注： OD值 0.2 为阳性，感染组有一只效价在 1102 400时 OD值=0.2； 对照组 4只在效价为 1102 400时 OD值均 0.2 ，但此后没有进一步稀释检测。3 讨论嗜酸性粒细胞，尤其是构成其颗粒的主要基础蛋白质体外试验有抗寄生虫 的作用。啮齿动物用抗嗜酸性粒细胞血清处理后，与未处理的比较，荷蠕虫数 较多，体内试验也表现出嗜酸性粒细胞有抗寄生虫感染的作用 ( 刘约翰和赵慰先 1993) 。动物被蜱叮咬一次后，对蜱产生拒绝是过敏反应所致的结论由以下两方

17、 面观察得来：首先是致敏牛在蜱再次感染后，蜱叮咬处皮肤出现严重渗出，动 物开始搔痒不安，可能是致敏肥大细胞表面结合抗蜱唾液物质抗体，再次遇到 该唾液抗原后导致肥大细胞脱颗粒释放组胺等介质，使蜱叮咬处出现炎性反 应，改变附近毛细血管的渗透性，出现水肿，造成不利于蜱叮咬的环境；粒细 胞趋化因子的作用，吸引嗜酸性粒细胞等效应细胞积聚于蜱叮咬处，直接作用 于蜱，并继续释放介质。其次是牛对蜱的免疫应答组织学观察发现蜱叮咬处嗜 酸性粒细胞大量积聚 (Riek,1962) 。 Brown等 (1984) 在蜱叮咬处发现嗜碱性粒细 胞，而嗜碱性粒细胞也可以和肥大细胞一样特异性致敏，再次遇到该种抗原脱 颗粒释放

18、组胺等介质，作用于嗜酸性粒细胞等效应细胞，因而认为嗜碱性粒细 胞在蜱感染方面占主导地位。 Brown 等(1984) 认为牛对美洲花蜱产生抗性与皮 肤嗜碱性粒细胞的应答有关。豚鼠对美洲花蜱的免疫也是依靠嗜碱性粒细胞的 应答，并且有 T 组胞和 IgG1 抗体参与 (Brown 和 Askenase,1981;Brown et al.,1982). 牛对微小牛蜱的免疫抗性被认为是依赖肥大细胞的皮肤过敏反应， 特征是皮肤有嗜酸性粒细胞浸润。本次实验应用长角血蜱幼虫感染兔，首次用 500 只幼虫致敏，第二次用 300只攻击，蜱叮咬处仍以嗜酸性粒细胞浸润为 主，偶有少量嗜碱性粒细胞出现，主要表现为型过

19、敏反应。这与 Ushio 等 (1993) 关于长角血蜱幼虫感染 WBB6F1-小+ 鼠所得结论相一致。虽然有大量实验证明硬蜱多次感染动物，可以使动物获得部分保护力，但 是也有关于硬蜱感染动物使得宿主免疫功能被抑制的报道， Wikel(1982) 用安氏 革蜱(Dermacentor andersoni) 感染豚鼠，能抑制体外培养的豚鼠 T细胞对 ConA和 PHA增殖应答反应，抑制程度最大的是在第一次感染之后，而第二次感 染很可能因宿主产生抗体，中和再次进入宿主体内的抑制因子，使抑制程度降 低。通过给受感染豚鼠免疫绵羊红细胞，进行溶血试验，发现第一次感染组血 清效价比对照组低，而在第二次感染

20、后的第 4d 已恢复正常，意味着安氏革蜱感 染引起的免疫抑制可能持续时间不长。 Woodman等 (1990) 认为在刚果革蜱 (Dermacentor congolensis) 抗原存在下引起 Th 细胞的应答。蓖子硬蜱 (Ixode ricincus) 若虫第一次感染 BALB/c小鼠，在蜱叮咬处 CD4+与 CD8+比率为 2.2 1；第二次和第三次感染后，叮咬处二者比率分别为3.2 1和4.7 1(Mbow et al.,1994) 。蜱对宿主免疫抑制机制的建立，增加了蜱在免疫胁迫的环境中生存的能力。 Inokuma 等 (1993) 报道微小牛蜱对牛有同样的抑制 作用。 Koney

21、等 (1994) 认为牛对彩饰花蜱 (Amblyomma variegatum) 越易感，荷 蜱数越多，免疫功能越受到抑制。蓖子硬蜱多次感染能抑制宿主B 细胞产生抗体，降低肥大细胞在蜱叮咬处数量 (Dusbabek et al.,1995) 。本实验对长角血 蜱幼虫多次感染大鼠的淋巴细胞转化试验，也发现感染组对ConA诱导增殖应答反应 SI( 刺激指数 ) 较低，且血清效价也相对较低，说明大鼠的免疫功能受到抑 制。长角血蜱三龄期虫体感染有共同抗原 (赵忠芳， 1997)，很可能若虫和成虫 感染也会出现免疫抑制。选择蜱唾液腺分泌物作为抗原时应慎重，避免引入对 宿主免疫功能有抑制的物质。参考文献1

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