组织与细胞化学重点综合

1、组织细胞化学一、名词解释：1、异染现象：染料离子以某种方式使它对所吸收的波长有所改变，因而观察到被染的组织显示与该染料本身颜色不一样，此现象为异染现象。2、自发荧光：由于紫外线的照射，标本中的荧光物质吸收光能后，呈现出不同颜色的荧光，这是自发荧光。3、诱发荧光：细胞内的某些成分只有与荧光素结合后，在紫外线的激发下，才可呈现一定颜色的荧光，称为诱发荧光。4、原位杂交组织化学：是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统通过组织化学或免疫组织化学在核酸原有的位置进行细胞内定位。5、荧光免疫组织化学: 免疫荧光组织化学是根据抗原抗体

2、反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)的一门技术。6、点计数：计数落于所测图像内（轮廓面）内的测数点。7、交叉点计数：计数测线与所测图像的周界线之间形成的交叉点的数目。8、DAB：是3，3-二氨基联苯胺（DAB），HRP使DAB氧化形成棕黄色产物，可在光镜和电镜下观察。9、DAB系统：一种常用的显色系统。是过氧化物酶的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成棕褐色不溶性产物。用于检测过氧化物酶的活性，灵敏度高，特异性好。其适用于蛋白质杂交和免疫化学，以及原位杂交染色等。产品即到即用，性能稳定，

3、操作便捷，敏感度高，显色清晰，重复性好。10、各向同性：是指特征物（包括平面特征物）在各个方向上都分布均匀的特性。11、各向异性：是指特征物在各个方向上分布不均匀的特性。12、饲养细胞：在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞(Feeder cell)。13、抗体效价滴度：指抗体在保持其最佳特异性染色，并且具备最小背景条件下的最高稀释倍数。14、生物素标记法：生物素标记cDNA探针用于检测双链DNA。11、灰度：是指一个像素色泽的深浅，它以整数值的形式表示，可表示为K=0，1,2k个级别，称量化级别。灰度值越小，表

4、示染色深度越强，物质含量越高。15、光密度（OD）：是指光线通过某一溶液或物质前的光强度I0和该光线通过溶液或物质后的折射光强度I0比值的对数值，OD=log（I0/Ib）。16、抗原表位：又称抗原决定簇，指抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，能被免疫活性细胞所识别，能与相应抗体的可变区结合。 17、特征物：就是要定量研究的形态结构，即感兴趣的某种组织结构，它具有一定的形状和分界,在肉眼或显微镜下可以识别或分辨。18、荧光染料：是指需要经过波长很短（低于400nm）的紫外线照射激发以后而发出荧光的一类特殊染料。19、像素：显示屏上看到的图像的最基本单元，实际上是构成图像的密集的、色泽深浅不

5、一的点。20、免疫组织化学：将化学反应中呈色反应与免疫学抗原抗体反应结合起来，用标记的特异性抗体（或抗原）对细胞及组织内抗原（或抗体）的分布进行组织或细胞内原位检测的一门技术。21、形态计量术(morphometry)：是运用数学和统计学原理对组织和细胞内各种成分的数量、体积、表面积等的相对值与绝对值的测量。22、不完全抗原：只有反应原性而无免疫原性的物质称半抗原或不完全抗原，绝大多数低分子量的多糖和所有的类脂均属半抗原。 23、免疫原性：指的是它能刺激机体免疫系统产生免疫应答。24、反应原性：指的是它能与抗体或致敏淋巴细胞特异性地结合而发生反应。25、体视学：是从特征物的截面或投影图像，定量

6、研究或描述特征物，确定其空间结构的科学。26、盲眼抽样：将一器官完全切成大小相似的组织块，盛于一容器内，事先确定抽取多少组织块，闭眼从容器内任意抽取所需数目的组织块，或者不断摇晃组织块，总是从某一位置抽取，或请外行任意抽取。27、绝对参数：为与参照系大小无关的参数。28、相对参数：为与参照系大小有关的参数，指单位体积内的量占多少比例。费莱特直径测量：轮廓面的费莱特直径是指某一方向的与轮廓两端相切的两条平行线直线之间的距离。29、宽度测量：某一侧边界线上一点至另一侧边界线的最短直线距离。30、截距测量：侧线穿过特征物的两侧时，在特征物内的测线线段的长度即截距测量。31、点取截距测量：利用有测点的

7、测线，当测点位于特征物图像内时，就沿测线方向测量位于特征物内的测线线段的长度。32、总体：所研究对象的全体。33、总体含量：构成总体的所有元素的数目。34、单克隆抗体：针对抗原分子上某一抗原决定簇的特异性抗体。35、电子显微镜技术：用电子束代替可见光，用电磁透镜代替光学透镜，用荧光屏将肉眼不可见的电子呈像。二、填空题：1、透射电镜术：用戊二醛与锇酸进行两次固定，脱水后用树脂包埋，用超薄切片切机切片，再经醋酸铀和柠檬酸铅染色。2、扫描电镜术：观察表面立体结构，用冷冻蚀刻法观察断裂面微细结构，特别是质膜。3、形态学描述主要包括三个方面：大小和多少、形状、构筑或空间分布。空间分布又包括：地理分布、定

8、向分布、大小分布（频率或变异系数）。4、形态定量特征：度量特征、拓扑特征。5、常用参数两类：绝对参数（体积、表面积、长度、数目）、相对参数（体积分数、表面积密度、长度密度、数密度）。6、随机抽样主要有：单纯抽样、等距抽样、加权抽样、分层抽样、阶段抽样和各向同性抽样。7、测格三要素：测点、测线、测面。8、长度测量包括：费莱特直径测量、宽度测量、截距测量、点取截距测量。9、石蜡切片基本程度：取材、固定、洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、染色、封藏。10、石蜡切片常用染色法：HE即苏木精伊红。苏木精为碱性染液，使细胞核中的染色质与细胞质的核糖体染成紫蓝色；伊红碱性，使细胞质和细胞外着红色。制

9、作较大组织块地切片时，用火棉胶包埋，进行组化或免化，则用冰冻切片、涂片法（血液涂于玻片上）、铺片法（膜）、磨片法（骨）。11、硝酸银染色神经组织与网状纤维。（PAS）过碘酸希夫反应多糖类物质、紫红色 苏丹染料或四氧化锇脂类 呈黑色 醛品红弹性纤维 福尔根反应核酸 甲基绿与DNA呈蓝绿色，派若宁与RNA呈红色 巨噬细胞活体染色12、抗体的分类：单克隆抗体、多克隆抗体、基因工程抗体。13、抗体的特性：亲和力、抗原与抗体结合的专一性与交叉性、抗体效价、抗体的稳定性。14、免疫球蛋白：单体：IgG、IgD、IgE、血清型IgA；双体：分泌型IgA；五聚体：IgM。15、Bclz亚家族 抑制细胞凋亡；B

10、ax亚家族 促进细胞凋亡。16、固定：（石蜡切片）10%中性福尔马林液、（冰冻切片）丙酮。17、固定的对象是蛋白质，固定剂必须具有凝固或沉淀蛋白质，强的渗透力。固定剂作用方式：使蛋白质变性、固定剂与蛋白质发生化合作用、使蛋白质冻胶化。18、Bouin液：苦味酸饱和水溶液、甲醛、冰醋酸（渗透力强）19、Carnoy液：无水乙醇、氯仿、冰醋酸（多用于糖原DNA）20、常用脱水剂：乙醇、丙酮、正丁醇、叔丁醇。21、透明目的：组织块透明便于津蜡包埋，切片有利于光线的透过。透明剂：二甲苯、苯、甲苯、香柏油。22、酸性染料（阴离子染料）生色团位于其分子的阴离子处。碱性染料（阳离子染料）生色团位于其分子的阳

11、离子处。23、相差显微镜观察生活细胞或未经染色细胞的形态结构，结构特点：小环状光阑聚光器、位相板、中心望远镜装置。n亮。 n+1/2暗。24、几种特殊显微镜术：相差显微镜、干涉微分相差显微镜、荧光显微镜、暗视野显微镜、共焦激光扫描显微镜。25、细胞分离技术：差速离心、密度梯度离心（速度沉降和等密度沉降）。26、差速离心细胞沉降顺序：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高尔基体，最后是核蛋白体。27、密度梯度离心常用介质氯化铯、蔗糖和多聚蔗糖。28、诱导细胞融合方法：生物方法、化学方法（PEG）、物理方法。暗示野显微镜：观察微小颗粒运动。29、组织化学的研究方法可分为两大类：一类是分离分析

12、法，另一类是原位分析法。30、目前，电子显微镜技术已成为研究机体微细结构的重要手段。常用的有透射电镜和扫描电子显微镜。与光镜相比电镜用电子束代替了可见光，用电磁透镜代替了光学透镜并使用荧光屏将肉眼不可见电子束成像。 三、问答题：1、原位杂交组织化学基本技术和步骤：由于核酸探针的种类和标记物的不同，在具体应用的技术方法上也各有差异，但其基本方法和应用原则大致相同。大致可分为：杂交前准备，包括固定、取材、玻片和组织的处理，如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等； 杂交； 杂交后处理； 显示（visualization）：包括放射性自显影和非放射性标记的显色。步骤：（1）原位杂交组织化学标本的制备

13、：取材、固定、切片 （2）杂交前处理：包括增强组织的通透性和核酸探针的通透性和减低背景染色两个方面（3）杂交反应：杂交液的成分与预杂交液基本相同，所不同的是加入了标记的核酸探针。（4）杂交后处理：杂交后处理的目的是除去未参与杂交体形成的过剩探针，除去探针与组织标本之间的非特异性结合，包括与那些与靶核酸相似的序列与探针之间形成的含非互补碱基对的杂交体，从而减低背景。杂交后处理主要包括系列不同浓度、不同温度的盐溶液的漂洗。（5）显示：放射性同位素标记探针的显示、非放射性标记探针的显示2、原位杂交组织化学中杂交前准备如何操作？杂交前处理主要包括增强组织的通透性、减低背景染色两个方面。（1）增强组织的

14、通透性和核酸探针的通透性增强组织通透性常用去污剂或某些消化酶处理，通过这种处理，可广泛地去除蛋白质而增强组织的通透性和探针的穿透性。常用的去污剂是Triton-X100，一般都将切片浸入含0.20.5% Triton X-100的PBS内15min。 蛋白酶K的消化作用在原位杂交中十分重要。蛋白酶K还具有消化包围靶DNA的蛋白质的作用，从而提高杂交信号。（2）减低背景染色a、酸酐和稀酸处理稀酸处理能使碱性蛋白变性，如再结合蛋白酶消化，即可将碱性蛋白移除，这样不仅能增强靶核酸探针的可及性，也可避免碱性蛋白与核酸之间的非特异性结合，达到解降低背景的目的。 b、预杂交以阻断标本中可能与探针产生非特异

15、性结合的位点，达到减低背景染色的目的。c、内源性生物素和酶的抑制 组织中内源性生物素、过氧化物酶或AKP则应事先阻断。标本可用不标记的卵白素生物素孵育，以阻断内源性生物素。杂交前蛋白酶消化有利于消除内源性生物素的干扰。用5脱脂奶粉缓冲适宜的盐液来稀释标记的卵白素以及将标记标本浸于含2牛血清白蛋白的缓冲液，均可防止或抑制标记的卵白素与组织标本之间的非特异性结合。3、免疫组织化学的结果判定：免疫组化的呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。 （1）阳性反应的染色特征 阳性反应染色分布有四种类型：细胞间质、胞浆、细胞核、细胞膜表面。 阳性细胞分布呈灶性和弥漫性。由于细胞内含抗原量

16、不同，所以染色强度不一。如果细胞之间染色强度相同，常提示其反应为非特异性。阳性细胞染色定位于单个细胞，且与阴性细胞相互交杂分布；而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。切片边缘、刀痕或皱褶区域，坏死或挤压的细胞区，常表现为相同的阳性染色强度，不能用于判断阳性。（2）假阳性及其处理 所用的抗体与其它无关的抗原有交叉反应，特异性差，特别是使用多克隆抗血清时较易出现；组织细胞内含有DAB沉淀相类似的色素。假过氧化物酶活性：组织中存在红细胞时，即不加过氧化物酶，也可出现阳性结果。内源性过氧化物酶活性：过氧化物酶体等存在过氧化物酶，能够与H2O2 DAB反应，导致假阳性。游离醛基：用小分子赖氨

17、酸、白蛋白等预先孵育切片，可封闭之。疏水键和离子键：用正常羊血清于第一抗体前孵育切片可消除之。天然抗体及不纯抗体：增加第一抗体的稀释度，可以降低上述抗体的非特异性染色。（3）非特异性染色特征 组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称非特异性背景染色。常出现在切片边缘、刀痕或皱褶区域，坏死或挤压的细胞区，表现为无一定的分布规律，常呈现某一部位成片的均匀着色。（4）免疫组化染色结果的定量分析 4、细胞凋亡免疫学原理及其检测方法： 凋亡机制：（1）Caspase依赖的细胞凋亡Caspase特点：以酶原的形式存在、酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性、水解天冬氨酸C端肽键。.Caspase可激活CAD (ca

18、spase-activated DNase)核酸酶，该酶在核小体的连接区将DNA切断，形成约200bp整倍数的核酸片段。正常情况下， CAD与抑制物ICAD-DFF-45结合，存在于胞质中，无活性。Caspase活化后降解抑制物ICAD， CAD激活并入核降解DNA使其片段化。（2）Caspase非依赖的细胞凋亡（Caspase-independent apoptosis） a凋亡诱导因子（AIF）：线粒体蛋白AIF释放到胞质内与抑制凋亡的因子结合，从而促发凋亡 b钙超载：胞浆（Ca2+） 激活核转录因子，加速凋亡相关基因的转录 激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，降解DNA链 激活谷氨酰

19、胺转移酶，使细胞骨架分解凋亡小体 细胞凋亡 细胞凋亡检测： 1、细胞凋亡的形态学及流式细胞术检测 2、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 3、线粒体膜势能的检测 4、DNA片断化检测 5、TUNEL法 6、Caspase-3活性的检测 7、凋亡相关蛋白TFAR19的表达和细胞定位分析1、细胞凋亡的形态学检测：光学显微镜和倒置显微镜 未染色细胞：凋亡细胞V变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，晚期可见凋亡小体。染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜：一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋

20、亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO ,Hoechst 33342;HO, Hoechst 33258; DAPI。电子显微镜观察电镜观察：凋亡细胞体积变小，胞质浓缩。凋亡期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多空泡结构。IIa染色质高度凝集、边缘化。凋亡晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。2、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）Phosphatidylserine(PS) 正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期从细胞膜的内侧翻转到膜表面Annexin-V： Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、R-PE）标记后作为探针，利用

21、流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，在Ca2+存在的情况下，与磷脂酰丝氨酸有很高的亲和力，因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。细胞凋亡与坏死的最大区别为前者的细胞膜保持完整，而后者的细胞膜破碎。PI（碘化丙啶）作为一种可嵌入DNA双链的红色荧光物质，不能通过完整的细胞膜，因此对活细胞和早期凋亡的细胞不能染色，但可进入坏死细胞（包括晚期凋亡细胞），使其发出红色，因此通过荧光素标记的Annexin V和PI对细胞进行双染色，可将早期凋亡细胞，活细胞和坏死细胞区分开来。3、线粒体膜势能的检测 线粒体荧光

22、染料：Rhodamine 123、DiOC6（3）、JC-1、TMRM等对线粒体膜电位非常敏感，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。4、DNA片段化分析细胞凋亡时染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成180?200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。5、TUNEL法6、Caspase活性检测7、凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析 凋亡早期TFAR19表达并出现快速核转位现象，伴随着细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针进行TFAR19

23、蛋白的细胞定位分析。凋亡的生理学意义:1、胚胎发育期去除某些细胞2、维持内环境稳定 增殖细胞群中细胞去除、去除潜在有害的自身反应性淋巴细胞3、参与防御反应 细胞毒T细胞细胞凋亡在疾病防治中的意义 合理利用凋亡相关因素1.诱导靶细胞凋亡 放疗、化疗（抑制Bcl-2抗凋亡作用 促进促凋亡基因作用 增强P53促凋亡作用）高热、高温2.减少细胞凋亡 ：NGF、促生长因子、抗氧化剂 干预凋亡信号转导 调节凋亡相关基因 控制凋亡相关酶学机制 防止线粒体跨膜电位的下降5、形态学定量研究方法： 显微分光光度计的应用、流式细胞计的应用、图像分析技术（体式学技术） （1）用平行单色光透射样品（切片、涂片），通过测

24、定被吸收光的峰值来检测某成分的含量，如核酸、某些燃料、某些酶组化反应物等，通过显微分光光度计可检测器含量。 （2）流式细胞计是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速存储、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群分选出来。（3）图像分析技术包括自动图像分析仪和人工图像分析仪。6、体视学技术的基本方法： 体视学定量研究的基本步骤有三步：获取要测量的组织图像；在图像上叠加或叠映测格，然后进行点技术等测试；将测试结果代入相应公式，经简单的数学运算后得出估计结果。（一）设计1、确定特征物 即根据研究的目的确定研究指标，如器官、

25、组织、细胞、结构等2、选择参数 参数的选择主要由研究目的决定。确定研究的目的，即建立要检测的假设，希望得到什么样的结果，将要说明什么问题等。常用参数：绝对参数（体积、表面积、长度、数目）与参照系大小无关的参数，有单位，更具说服力；相对参数（体积分数、表面积密度、长度密度、数密度）与参照系大小无关的参数，指单位体积内的量占多少比例。（二）抽样抽样的原则是随机原则或等同可能性原则。抽样方法主要有单纯抽样、等距抽样、加权抽样、分层抽样、阶段抽样和各项同性抽样六种形式。常用的是单纯抽样和等距抽样。抽样设计的考虑：1、理想的抽样 即抽样方法和样本含量理想的抽样。理想的抽样方法必须是随机的，不同情况下选择

26、合适的抽样方法，而刚好能获得被认为是准确、可靠的估计的样本含量就是理想的样本含量。2、抽样设计的注意事项 （1）、确定总体或参照空间，样本要取自整个参照空间。（2）、样本含量不是由参照空间的大小确定的，而是由特征物在参照空间内的分布情况、抽样方法和拟获得的一定的准确性确定的。（3）、研究样本并非为研究而研究，而是为了研究或推论其发源地总体。因此，样本的抽取应该是随机的，应排除主观影响。（4）、抽取切片、视野等研究一定条件下的某种生物器官时，实际用于计算平均估计值、标准差等的样本是生物器官构成的样本，样本含量就是生物器官的数目。（5）、阶段抽样的重点是较初级阶段的抽样。阶段抽样的原则是：宁多而粗

27、，勿少而精。（6）、样本含量是否足够的经验判断方法是：看最终计数的测点数是否接近于100200个。若已达100200个，则样本含量往往已足够。（7）、注意选择适当的显微镜放大倍数。（8）、做一试点研究或实际考察对于抽样设计是很有用的，尤其是对于一项新开始的研究。（三）测试测试工具：测格测格三要素：测点、测线、侧面测量方法：点计数、特征物计数和长度测量 长度测量：费莱特直径测量、宽度测量、截距测量、点取截距测量（四）注意事项各向同性是指特征物（包括平面特征物）在各个方向上都分布均匀的特性。各向异性是指特征物在各个方向上分布不均匀的特性。7、图像分析仪：图像分析仪又称图像分析系统，是利用计算机处理

28、图像，从而获得有关图像的形态定量信息和灰度信息等的综合装置。像素：显示屏上看到的图像的最基本单元，实际上是构成图像的密集的、色泽深浅不一的点。灰度：是指一个像素色泽的深浅，它以整数值的形式表示，可表示为K=0，1,2k个级别，称量化级别。光密度（OD）：又称光吸度，是指光线通过某一溶液或物质钱的光强度I0和该光线通过溶液或物质后的折射光强度Ib比值的对数值。8、免疫荧光化学技术的注意事项：（一）造成非特异性荧光的原因有：组织细胞成分的自发荧光；由于结缔组织、衰老细胞的非特异性吸附；蛋白质中带有过多的负电荷；或者由于技术原因所造成，如抗体不纯所出现的交叉反应；或由于标记用的荧光素质量差等。（二）

29、消除非特异性荧光的方法有：（1）用于标记的抗体应该特异性强并且效价高，标记后通过层析或透析的方法去除游离的荧光素。（2）载玻片、盖玻片应清洁，无自发荧光。（3）非免疫血清，如10%牛血清白蛋白先孵育切片，再进行荧光抗体的反应。（4）将抗体的浓度调整到高度稀释，并且是相应抗原-抗体反应的适合浓度，如1:1000和1:2000均有免疫阳性，则应采用1:2000的浓度。（5）观察标本时，必须用无自发荧光的镜油。9、免疫组织化学技术的分类：一 、根据标记物是否与特异性第一抗体结合分类1.直接法 将标记物与第一抗体结合后，直接加到细胞或组织上，在适当条件下，抗体与抗原反应。2.间接法 与（待检物）抗原特

30、异性结合的第一抗体未被标记，而第二抗体以荧光素、酶或胶体金等标记。常用的标记物有荧光素和酶。荧光素标记的称为免疫荧光法常用的萤光素有异硫氰酸荧光素、罗丹明等。酶标记的称为酶标免疫法，常用的酶有辣根过氧化物酶，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。 抗体与抗原的结合方法可分为直接法和间接法两种，直接法是将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位。而间接法则是在抗体抗原初级反应的基础上，再用带标记的次级抗体同初级抗体反应，从而使初级反应得到放大，显示增强。二 、根据标记物或呈色物的不同分类(一)免疫荧光法(二)免疫酶组织化学法免疫酶组织化学法是抗原抗体的特异性与酶的

31、高效催化作用相结合的一种免疫标记法。通过用酶标记抗原或抗体的示踪，对呈色反应后的有色化合物进行分光光密度的测定，可对免疫阳性产物做半定量的分析。此方法被广泛应用于医学和生物学的各个领域。其研究方法及分类如下：1常用的标记酶 1)辣根过氧化物酶（HRP）易获得,分子小,易穿透到细胞内. 2)碱性磷酸酶(ALP) 3)葡萄糖氧化酶2非标记抗体免疫酶法 将所用抗体均不做标记，利用二抗作为桥，将一抗和终抗体连接起来，其中终抗体为抗酶抗体，来自与一抗相同的动物种属，为将酶免疫动物后得到。目前最常用是未标记酶法是将桥抗体与一抗和标记的检测试剂复合物连接起来，后者包括氧化物酶-抗过氧化物酶复合物（PAP）、

32、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物以及抗生物素蛋白-生物素-氧化物酶复合物。（1）PAP法 (2)双桥PAP法 (3)APAAP法3亲和免疫组织化学技术卵白素（Avidin）:又称抗生物素、亲和素， 具有4个与生物素亲和力极强的结合点。链霉亲和素（strept avidin）是一种从链霉菌培养物中提取的蛋白质， 和亲和素一样，也有4个生物素结合位点。生物素（Biotin）: 维生素H，是一种小分子的维生素。抗生物素具有4个与生物素亲和力极强的结合点，这种亲和力较抗原抗体的亲和力高100万倍，而且不影响彼此的生物学活性，同时生物素与抗生物素都具有与其他示踪物质如荧光素、铁蛋白和HRP相结合能力，由此

33、建立了抗生物素生物素免疫染色系统，包括抗生物素生物素过氧化酶复合物技术（ABC）及链霉亲合素生物素过氧化酶（或碱性磷酸酶）合复技术（SABC）。（1）抗生物素蛋白-生物素技术1）桥连抗生物素生物素法（BRAB） 2）抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合法（2）葡萄球菌A蛋白法 其能与某些动物IgG的Fc段非特异性结合，将SPA替代桥抗体，把酶、荧光素等标记在SPA上，标记的SPA 就可直接检测组织细胞内的IgG成分或免疫化合物。（3）凝集素法ABC法（亲合素-生物素-过氧化物酶复合物法） 其具有与特定糖基专一结合的特性，用酶、胶体金等标记凝集素，利用其能与细胞糖基和细胞膜上的微细结构。 （4）

34、酶标链酶抗生素蛋白-生物素法（LSAB）采用生物素标记的第二抗体与链霉抗生物素蛋白连接的过氧化物酶来测定细胞和组织中的抗原。（5）链酶抗生素蛋白-过氧化物酶法（SP）是根据链酶抗生素蛋白-过氧化物酶法连接系统设计应用于检测组织和细胞内抗原的一种高敏方法 4放射自显影标记法 放射自显影术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的

35、放射性即可使乳胶感光。然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量，放射自显影的切片还可再用染料染色，这样便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或相对定量测定。这种技术与电镜样品处理，则为电镜放射自显影。5胶体金法 用胶体金颗粒作为示踪物或探针标记抗体，利用抗原-抗体的特异性反应，从而对细胞内外的或细胞表面的多糖、糖蛋白、多肽、激素和核酸等生物大分子予以精确定位。12、显示细胞和组织成分、结构的方法（1）光学显微镜技术：一般光学显微镜技术、特殊光学显微镜技术（荧光显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、激光共焦扫描显微镜）（2）电子显微镜技术：透射电镜术、扫

36、描电镜术（3）组织化学技术：普通组织化学技术、免疫组织化学技术、原位杂交技术（4）放射自显影技术（5）细胞培养技术与组织工程（6）形态计量分析技术10、常用固定剂的优缺点：答：一)、单纯固定剂：A 甲醛（纯甲醛为一种气体）溶于水成为甲醛水溶液或称福尔马林。市面上出甲醛浓度通常为37-40% 。甲醛使用时，需采用新鲜的。放置时间较长的甲醛会变成多聚甲醛。为强的还原剂，其不可与氧化剂混合使用。 作为固定剂的优点：渗透力强，使组织收缩少，固定均匀 。能较好的固定脂肪，神经及髓鞘，且能固定高尔基体，线粒体。缺点：不能固定白蛋白和核蛋白。B 乙醇（为无色透明的液体)其可与水与任意比例混合。优点:可以沉淀

37、白蛋白,球蛋白,核蛋白。缺点: 不宜作低温固定 ,渗透力较弱,使组织收缩,酒精浓度超过50%可溶解组织内的脂肪.类脂体,血色素等。C 醋酸（具刺激味的无色液体) 固定组织通常用5%的HAC。PH2-6，能防止细胞自溶及腐败。 优点: 其能沉淀核蛋白,是种好的染色质固定剂.穿透速度快.固定时间较短,通常1小时即可。缺点:其不能沉淀白蛋白、球蛋白使组织膨胀,高浓度HAC会破坏线粒体和高尔基。D 苦味酸(常见的一种酸)为一种强酸,黄色结晶.其在干燥空气中激烈晃动,会发生爆炸,苦味酸的运输以溶解在水中的饱和苦味酸,浓度为1%。作为固定液的优点: 能沉淀所有的蛋白质。 缺点: 使组织收缩，穿透力弱。 E

38、 重铬酸钾 橙红色的结晶,强氧化剂,不可与还原剂(酒精)等混用.重铬酸钾溶液中加醋酸后,产生铬酸,才能使蛋白质产生沉淀。优点:穿透力较强。缺点:使组织产生一点膨胀。F .锇酸(四氧化锇)为黄色的结晶,为强的氧化剂。优点:其为脂肪及类脂体的唯一的固定剂,能将线粒体及高尔基体固定成为黑色. 可保持组织柔软。缺点:穿透速度慢,难固定组织,毒性高,易损伤眼睛及黏膜,价格昂贵。G 氯化汞:通称升汞,剧毒,呈白色粉末状,以针状结晶为最纯。 优点:其对蛋白质有较强的沉淀作用,能沉淀一切蛋白质(包括核蛋白)，能充分固定细胞质和细胞核。缺点：二)、混合固定液：.Bouin液 苦味酸饱和水溶液甲醛冰醋酸该固定液渗

39、透力强,使组织收缩少.固定时间12-24小时.Carnoy液 无水乙醇氯仿冰醋酸对组织穿透速度快,多用于糖原,脱氧核糖核酸固定.Zenker液 重铬酸钾升汞双蒸水冰醋酸采用该液,须脱汞处理. Helly液 重铬酸钾升汞双蒸水甲醛11、显示酶注意的要点：1、 对标本的处理和制片不能影响酶的活性及分布；2、 所选择的底物及辅助物必须能迅速和同步渗透到组织和细胞当中去；3、 所选择的第五最好只能被一种酶催化分解；4、 所选择的辅助物不影响酶活性及其他反应剂穿透进入细胞；5、 FRP必须能够迅速与辅助物进行反应，而且FRP是水不溶性的有色而稳定的物质；6、 所有参加反应的试剂都不能与组织细胞内除了所检

40、测的酶以外的任何成分自行吸附和集合。12、标记抗原法凝集素：是一种提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白质，可以使红细胞凝集。能与特定糖基专一结合。用酶、胶体金等标记凝集素，研究细胞上的糖基和细胞膜上微小结构。ABC法：是抗生素蛋白生物素过氧化酶复合物法简称，是将抗生素蛋白作为桥，把生物素化的抗体与生物素结合的酶连接起来。 原理：将特异性一抗与组织细胞相应抗原结合后，通过生物素蛋白与一抗结合，借助抗生物素蛋白与生物素的天然亲和性将生物素与过氧化物酶连接为复合物，通过酶促反应，显示组织细胞相应抗原。ABC复合物：将抗生物素蛋白与过氧化物酶标记的生物素按一定比例混合，使抗生物素蛋白分子上的三个生物素结合位点被酶标记的生物素所占据，空下一个结合位点，这样形成的复合物即称ABC复合物步骤：一抗与组织切片共孵育（使特异性一抗与组织中的相应抗原结合）加上生物素标记的二抗加入ABC复合物，二抗上的生物素则与ABC复合物中的抗生物素蛋白上空下的位点结合优点：敏感性较PAP法提高2040倍，因引入酶分子数增加 二抗不必过剩，所以一抗和二抗可高度稀释，使背景染色下降，信噪比明显提高13、试述荧光显微镜的原理、结构及生物学应用答：原理：由于紫外线的照射，标本中的荧光物质吸收光能