《酶的组织化学》ppt课件

1、酶组织化学反响主要经过两步：酶组织化学反响主要经过两步：1.1.酶促反响，即酶催化细胞内相应底物，酶促反响，即酶催化细胞内相应底物，生成无色的初级反响底物。生成无色的初级反响底物。2.2.显色反响，捕获和偶联。将初级反响产显色反响，捕获和偶联。将初级反响产物与捕获剂反响，经过一步或两步反响物与捕获剂反响，经过一步或两步反响生成有色的最终反响产物，或将初级反生成有色的最终反响产物，或将初级反响产物与一些偶联剂发生偶联反响生成响产物与一些偶联剂发生偶联反响生成有色沉淀，显示酶活性部位。有色沉淀，显示酶活性部位。遵照原那么：遵照原那么：1.1.尽量坚持组织细胞生活时的形状和构造。尽量坚持组织细胞生活

2、时的形状和构造。2.2.尽量坚持组织细胞生活时酶及其他成分的尽量坚持组织细胞生活时酶及其他成分的活性，不影响酶的活性和分布。活性，不影响酶的活性和分布。3. 3. 底物和辅助剂必需迅速而同步地浸透到组底物和辅助剂必需迅速而同步地浸透到组织和细胞中去。织和细胞中去。4. 4. 底物最好只能被一种酶催化分解。底物最好只能被一种酶催化分解。 5. 尽量减少初级反响产物在组织细胞内的弥散程度。 6. 反响产生的最终反响产物应是不溶于水的有色而稳定的物质，堆积于原位，其颜色深度与物质含量或酶活性应有一定量效关系。 7. 由于酶的活性可遭到很多要素影响，因此在酶生化方面有许多要求，以保证充分显示酶的活性：

3、 最适孵育温度25-37。C 最适pH值 最适底物及辅助物浓度 激活剂与抑制剂 酶的组织化学方法根本原理酶的组织化学方法根本原理沉淀反响法沉淀反响法 1. 1. 金属盐法金属阳离子沉淀金属盐法金属阳离子沉淀反响由于酶的活性可使孵育底反响由于酶的活性可使孵育底物分解，其生成的基团可与金属物分解，其生成的基团可与金属离子结合而产生沉淀，最后在酶离子结合而产生沉淀，最后在酶的活性部位生成不溶性的有色金的活性部位生成不溶性的有色金属盐沉淀。如钙属盐沉淀。如钙- -钴法显示碱性钴法显示碱性磷酸酶。磷酸酶。 2. 偶联偶氮色素法 由于酶活性可使含萘酚的底物化合物分解，其分解产物可与重氮盐结合，引起偶联偶氮

4、反响，构成不溶性的偶氮色素，以证明酶的活性部位。 电子传送法电子传送法 根据氧化复原的原理显示氧化酶根据氧化复原的原理显示氧化酶和脱氢酶。脱氢酶的作用使底物脱氢氧和脱氢酶。脱氢酶的作用使底物脱氢氧化，脱下的氢可与作为受氢体的无色四化，脱下的氢可与作为受氢体的无色四唑盐或双四唑盐结合，后者被复原成甲唑盐或双四唑盐结合，后者被复原成甲或双甲潜紫蓝色沉淀。如琥珀酸脱氢酶或双甲潜紫蓝色沉淀。如琥珀酸脱氢酶显示方法属于此法。显示方法属于此法。 水解酶类 水解酶催化以下反响 ： AB+H2O AH+BOH 包括酯酶、糖苷酶、肽酶、磷酸酶等。 碱性磷酸酶钙-钴显示法 原理：AKP在有激活剂Mg+存在和pH9

5、.4时，将磷酸盐底物分解产生磷酸根离子，磷酸根离子被孵育液中高浓度的钙盐所捕获，在有酶活性存在处生成磷酸钙沉淀，再参与硝酸钴，用Co2+置换 Ca2+ ，从而生成磷酸钴沉淀，因其无色需经过硫化铵处置构成黑色硫化钴颗粒沉淀，显示酶活性所在部位，此沉淀与AKP含量成正比。 试剂配制： 1. 作用液 2%巴比妥钠 5ml；3%-甘油磷酸钠 5 ml；2%无水氯化钙 10ml；0.1%硫酸镁 0.5 ml；蒸馏水 2.5 ml。 此液pH为9.4，如不到9.4，可用0.1N NaOH调理。 2. 2% 硝酸钴 3. 1-2% 硫化铵 现配 操作步骤 1. 新颖组织恒冷切片，切片直接入孵育液37。C 1

6、0-40 分钟。 2. 流水洗2分钟。 3. 2%硝酸钴5分钟。 4. 蒸馏水洗。 5. 硫化铵30秒-1分钟。 6. 蒸馏水洗。 7. 甘油明胶封固。 碱性磷酸酶碱性磷酸酶结果：结果： AKPAKP所在部位呈所在部位呈黑色硫化钴沉黑色硫化钴沉淀。淀。 6-磷酸磷酸葡萄糖酶葡萄糖酶结果：结果：酶活性处酶活性处为棕黄色为棕黄色硫化铅沉硫化铅沉淀，细胞淀，细胞核为阴性核为阴性反响。反响。 对照 去底物对照，作用液中以蒸馏水替代-甘油磷酸钠，其他步骤同上，酶反响阴性。 氧化复原酶氧化复原酶催化氧化复原反响的酶。催化氧化复原反响的酶。 琥珀酸脱氢酶SDH硝基四唑盐法 原理：琥珀酸脱氢酶SDH作用于底物

7、琥珀酸钠，脱下氢，以无色的硝基四唑盐为受氢体，后者获氢后被复原为不溶于水的有色甲潜，原位堆积于酶活性部位。 试剂配制试剂配制 0.2M0.2M磷酸缓冲液磷酸缓冲液pH7.6 5mlpH7.6 5ml1 1A A液液 0.2M0.2M琥珀酸钠琥珀酸钠 5ml5ml B B液液 0.1%0.1%1mg/ml1mg/ml硝基四唑盐硝基四唑盐Nitro-BTNitro-BT 10ml10ml 临用前将两液等量混合，调整临用前将两液等量混合，调整pHpH至至7.67.6。 操作步骤： 1. 新颖组织恒冷切片，切片直接入孵育液37。C 5-40分钟。 2. 蒸馏水洗。 3. 甘油明胶封固。 琥珀酸脱氢酶 结果： 酶活性部位为紫蓝色颗粒沉淀。 对照 另配一孵育液，以等量的蒸馏水替代0.2M琥珀酸钠液，酶活性部位