《鱼骨胶原蛋白改》ppt课件

1、1罗非鱼鱼骨胶原蛋白分别纯化实验方案课 程称号：微生物指点教师：林莹 教授实验组成员：黄欣欣、林静、颜明月、蔡达、胡丽琴.2一、理化性质一、理化性质二、实验器材二、实验器材三、提取分别三、提取分别四、四、SDS-PAGE目目 录：录：.3 物理性质：物理性质： 1等电点：在某一等电点：在某一pH溶液中表现出不溶液中表现出不带电荷，呈两性离子形状，即所带正电荷带电荷，呈两性离子形状，即所带正电荷和负电荷相等零电荷，这一和负电荷相等零电荷，这一pH称为称为蛋白质的等电点。蛋白质的等电点。 2溶解性：胶原蛋白往往出现两个等溶解性：胶原蛋白往往出现两个等电点，一个在电点，一个在pH 4.5 5.0；另

2、一个在；另一个在pH 6.8 8.0，所以胶原蛋白会出现两个最低溶，所以胶原蛋白会出现两个最低溶解度。解度。胶原蛋白理化性质胶原蛋白理化性质.4 化学性质：化学性质： 1两性电解质：两性电解质：pHpI时，蛋白质带时，蛋白质带负电，向阳极挪动；负电，向阳极挪动；ph=pI时，蛋白质不时，蛋白质不带电，不挪动。带电，不挪动。 2酸碱膨胀：胶原肽链间的氢键和离酸碱膨胀：胶原肽链间的氢键和离子键乃至共价键在酸或碱的作用下有所破子键乃至共价键在酸或碱的作用下有所破坏，使胶原构造松散。坏，使胶原构造松散。 3盐的作用：胶原在盐溶液中会发生盐的作用：胶原在盐溶液中会发生其肽链间的离子键被盐解离的阴、阳离子

3、其肽链间的离子键被盐解离的阴、阳离子翻开，从而吸水膨胀。翻开，从而吸水膨胀。 4显色反响：茚三酮反响、双缩脲反显色反响：茚三酮反响、双缩脲反响、酚试剂反响响、酚试剂反响.罗非鱼鱼骨胶原蛋白引见罗非鱼鱼骨胶原蛋白引见5罗非鱼骨根本成分罗非鱼骨根本成分 鱼排蛋白质中有鱼排蛋白质中有80%的胶原蛋白，主要为的胶原蛋白，主要为I型胶原蛋白，型胶原蛋白，II型胶原蛋型胶原蛋白可以从软骨中提获得到。其中白可以从软骨中提获得到。其中I型至少有两种型至少有两种肽链肽链 1和和 2组成，它们的分子大小、亚基构成很相近，含有大量组成，它们的分子大小、亚基构成很相近，含有大量肽链，肽链， 1含量接近含量接近含量，含

4、量， 1分子量约为分子量约为130 kDa， 2分子量约为分子量约为118 kDa， 分子量约为分子量约为200 kDa。成分成分蛋白质蛋白质脂肪脂肪水分水分碳水化碳水化合物合物灰分灰分胶原胶原含量%37.173.5120.10微量39.2430.97.6二、分别纯化二、分别纯化资料、药品及仪器实验方案.7资料、药品及仪器：资料、药品及仪器： 新颖罗非鱼市售、乙酸、柠檬酸、氯化钠、EDTA、乙醚、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂、蛋白质规范品、猪胰蛋白酶等(均为分析纯) 电子天平、粉碎机、冷冻枯燥机、电热恒温水浴锅、UV 分光光度计、高速冷冻离心机、聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳安装等。.实验流程：实验

5、流程：鱼排去除剩余鱼肉鱼排去除剩余鱼肉清水清洗晾干清水清洗晾干脱脂脱脂去除盐去除盐去除杂蛋白去除杂蛋白一切过程在10下进展，防止变性提取提取精制精制胶原胶原.91、鱼骨脱脂工艺、鱼骨脱脂工艺 取50g粉碎的鱼骨参与物料比为1:20的乙醚在4下浸泡1d。.102 2、鱼骨脱盐去杂工艺、鱼骨脱盐去杂工艺 取50g左右脱脂后的鱼骨粉，参与其质量5倍的0.5mol/L EDTA溶液pH 7.4于4下浸泡5 d，每天改换一次EDTA溶液，用蒸馏水反复洗涤，再以其质量20倍的 0.1mol/L NaOH溶液4下浸泡12小时，再用蒸馏水冲洗至中性。除去非胶原蛋白及防除去非胶原蛋白及防止内源性蛋白酶对胶止内源

6、性蛋白酶对胶原蛋白的影响原蛋白的影响脱钙作用脱钙作用.113、胶原的提取、胶原的提取 鱼骨经脱盐去杂后，参与等量的0.5mol/L乙酸溶液并在4下浸泡3d，提取液中含有1%的胃蛋白酶，5000r/min离心20分钟去除杂质，搜集上清液，即得到胶原粗提液。提取过程不断搅拌。酸溶性胶原酸溶性胶原切去末端切去末端肽，使三肽，使三螺旋构造螺旋构造的主体部的主体部分溶解在分溶解在稀酸中稀酸中.124、胶原的精制工艺、胶原的精制工艺 粗提液缓慢参与氯化钠粉末，使其终浓度到达0.9 mol/L，盐析过夜，5000r/min离心20分钟，弃去上清液，沉淀用10倍体积0.5mol/L的乙酸溶液溶解，5000r/

7、min离心20分钟去除杂质，上清液再次反复盐析、离心，溶解操作，最后用蒸馏水透析3天，每天改换透析液，冻干即得胶原精制品。.13四、检测方法四、检测方法SDS-PAGE电泳电泳原理：利用原理：利用SDS这种阴离子去垢剂，这种阴离子去垢剂，SDS带带有大量的阴离子，有大量的阴离子，SDS和蛋白质分子结合后和蛋白质分子结合后形生长柱形的复合物，形生长柱形的复合物，SDS在外侧，蛋白质在外侧，蛋白质分子在内测，从而使得和蛋白质分子的电泳分子在内测，从而使得和蛋白质分子的电泳速度独一有关系的是蛋白质分子量。速度独一有关系的是蛋白质分子量。蛋白质浓度：蛋白质浓度：Folin-酚试剂法酚试剂法原理：原理：Folin试剂中的磷钼酸试剂中的磷钼酸-磷钨酸盐被蛋磷钨酸盐被蛋白质中