实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定ppt课件

1、酸性磷酸酶酸性磷酸酶KmKm及及VmaxVmax值测定值测定清洗试管清洗试管2424支支 酸性磷酸酶：酸性磷酸酶： 催化磷酸单酯的水解反响催化磷酸单酯的水解反响 存在于人的肝脏，前列腺等处存在于人的肝脏，前列腺等处 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。植物中以发芽的种子中含量最为丰富。 是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测目的。的检测目的。 一、概述一、概述 酶液酶液 磷酸苯二钠磷酸苯二钠 苯酚苯酚 磷酸氢二钠磷酸氢二钠 folin-酚测定酚的浓度酚测定酚的浓度 计算出反响速度用产物生成量计算出反响速度用产物生成量/min来表来表示示 根据双倒数法计算出

2、根据双倒数法计算出Km及及Vmax 二、实验原理 V=VmaxSSKm+三、实验步骤：三、实验步骤：1 1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取2 2、制造酶反响时间与产物生成量的关系曲、制造酶反响时间与产物生成量的关系曲线线3 3、制造酚规范曲线、制造酚规范曲线 4 4、SS与与V0V0关系实验关系实验 5 5、双倒数作图法计算、双倒数作图法计算VmaxVmax和和KmKm buffersubstrateenzymeCertain TimeblankStop the reactionColor developed 生化实验课教师：于晓虹 实验报告请交到讲台上来 酶液稀释取上

3、清液微升，稀释倍，用大试管装 科代表李博恒 1、磷酸酶原液的制备： 称取5g绿豆芽茎去头去根，参与pH5.6的HAC缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟。纱布过滤，取1.8ml滤液,以6000rpm，离心20min，取上清。 上清液用pH 5.6的HAC缓冲液稀释30倍，用于实验。 2 2、制造酶反响时间与产物生成量的关系曲线、制造酶反响时间与产物生成量的关系曲线 目的：选取适宜的反响时间目的：选取适宜的反响时间 加加 液液 程程 序序 表表管号管号 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 0 0磷酸苯二钠磷酸苯二钠 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

4、 0.5 0.5 0.50.5 0.5酶液酶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.50.5准确反响时间准确反响时间 3 5 10 15 20 25 3 5 10 15 20 25 碳酸钠溶液碳酸钠溶液 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 酶液酶液 0.50.5FolinFolin酚溶液酚溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Folin Folin酚溶液已稀释好！酚溶液已稀释好！注：注： 进展酶促反响时，留意预热，使一切的反响在同等条件进展酶促反响

5、时，留意预热，使一切的反响在同等条件下开场下开场35保温保温10分钟分钟0123456反响时间反响时间03510152025吸光度吸光度结果：结果：以反响时间为横坐标，以反响时间为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制反为纵坐标，绘制反响进程曲线，并从该曲线上求出酸性磷酸酶反响初响进程曲线，并从该曲线上求出酸性磷酸酶反响初速率的时间范围。速率的时间范围。 3 3、制造酚规范曲线、制造酚规范曲线 目的：可从酚规范曲线上查出目的：可从酚规范曲线上查出A680nmA680nm所所相当的酚含量相当的酚含量, ,并计算出反响速度用每分并计算出反响速度用每分钟产物生成量来表示钟产物生成量来表示01234567

6、80.4mM phenol standard solution00.10.20.30.40.50.60.70.8H2O10.90.80.70.60.50.40.30.21M Na2CO3222222222Folin-phenol reagent0.50.50.50.50.50.50.50.50.5加加 液液 程程 序序 表表35保温保温10分钟分钟012345678酚含量酚含量/mol00.040.080.120.160.200.240.280.32吸光度吸光度结果：结果：以酚含量以酚含量mol为横坐标，为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制规范曲线。为纵坐标，绘制规范曲线。以以0号管作空白，在

7、可见光分光光度计号管作空白，在可见光分光光度计680 nm波优点读取各管的吸光度波优点读取各管的吸光度A680nm。 4 4、SS与与V0V0关系实验关系实验 实实 验验 加加 液液 程程 序序 表表管号管号 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 0 0磷酸苯二钠磷酸苯二钠 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.50 0.50 0.50 0.50 醋酸缓冲液醋酸缓冲液 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 - 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 - - - 酶液酶液 0.50 0.50 0.5

8、0 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 -0.50 - 精精 确确 反反 应应 15 15 分分 钟钟 35 35度度碳酸钠溶液碳酸钠溶液 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 FolinFolin酚溶液酚溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 酶液酶液 0.5 0.5 35 35保温保温1010分钟分钟测测680nm680nm处吸光度处吸光度 注：注： 进展酶促反响时，留意预热，使一切的反响在同等条件下进展酶促反响时，留意预热，使一切的反响在同等条件下开场开场 实验中需本卷须知：实验中需本卷须知： 酶反响作用时间准确控制酶反响作用时间准确控制 Tube number123456S (mM)0.50.7511