嗜盐菌的分离与鉴定

1、序号： 编码： 大学生课外科研立项申 请 书 项 目 名 称： 海洋中嗜盐菌的分离筛选及鉴定 所 属 学 科： 生物工程 申 请 者 姓 名： 王嘉伟 申请者所在单位： 10级生物工程(2) 固 定 电 话： 无 移 动 电 话：电 子 邮 箱： 1272484327 指导教师姓名： 高大威 指导教师所在单位： 环境与化学工程学院 共青团燕山大学委员会二一二年三月制申请人承诺我保证如实填写本表格各项内容。如果获得立项，承诺以本表为有约束力的协议，遵守燕山大学大学生课外科研立项管理细则，认真开展研究工作，取得预期成果。坚决杜绝抄袭等弄虚作假行为。如果成果发表或发布，我将

2、注明是燕山大学大学生科研立项项目。申请人（签字）： 年 月 日指导教师承诺我保证如实填写本表格各项内容。如果获得立项，承诺以本表为有约束力的协议，遵守燕山大学大学生课外科研立项管理细则，认真指导学生按时保质完成科研立项工作，并检查学生独立完成写作工作情况。指导教师（签字）： 年 月 日一、项目基本资料项目名称 海洋中嗜盐菌的分离筛选及鉴定类 别ü自然科学论文 科技发明制作A类预期水平国际领先国际先进 哲学社会科学论文科技发明制作B类国内领先ü国内先进学 科领 域DA机械与控制 B信息技术 C数理 D生命科学 E能源化工 F哲学 G社会 H经济 I法律 J管理 K教育摘要（研

3、究内容创新点和意义，150-200字）渤海湾石油泄漏造成海水污染，采用物理化学技术处理费用昂贵。嗜盐菌分布广泛，对其驯化培养后便可应用于高盐度的污水处理。虽然用嗜盐菌生物处理高盐度污水技术已应用于很多环境治理领域，但海水治理领域还未采用此技术。驯化出最佳嗜盐菌将会节约很多污水处理成本。因此对其研究能带来很好的经济效益和生态效益。预期成果AA. 发表论文 B.研究报告 C.科技制作实物 D. 专利 E.其他项目起止时间二、申请组基本资料申请者及项目组主要成员姓名性别年级联系电话学位学院专业项目分工陈坚强10级燕山大科环境与化学工程学院生物工程组长王伟伟10级燕山大学15

4、369708510本科环境与化学工程学院生物工程组员 张国龙 10级燕山大科环境与化学工程学院生物工程组员 赵长硕 10级燕山大科环境与化学工程学院生物工程组员第一申请人详细资料姓名 陈坚强性别男电子邮箱 1272484327学院环化学院专业 生物工程电 话关经 历（100字以内） 高中时参加过校级科研立项竞赛。大学学习刻苦努力，积极向上，学习成绩优异，获得老师与同学的一致好评，喜欢思考，动手能力较强。三、指导教师基本资料指导教师基本资料（1）姓名单位职称电话研究方向指导教师签字高大威燕山大学环境与化学工程学院副院长

5、教授8387553微生物学和分子生物学申报理由（指导教师填写本项。请说明该项目是否有项目支撑，是否有较高的科技价值等。） 目前，含盐采出废水的处理主要有物理、化学、生物方法，但物理和化学方法具有处理不彻底，费用较高、容易造成二次污染等而难以在实际中推广，经济、高效、安全且环保的生物处理技术为这一问题的解决提供了可能。多数含盐采出废水含盐量较高，普通微生物难以适应这样的高盐环境，严重影响了其在含盐采出废水处理中的应用。因此有必要探讨在高盐环境中能降解污染物的特殊微生物，即嗜盐菌，以解决含盐采出废水的处理问题，对实现石油生产和社会经济的可持续发展具有非常重要的意义。该实验所产生的科技价值是巨大的，

6、很具有研究价值。 指导教师基本资料（2）姓名单位职称单位研究方向指导教师签字申报理由（指导教师填写本项。请说明该项目是否有项目支撑，是否有较高的科技价值等。）四、项目具体内容(与课题论证活页内容同)1、选题：本课题国内外研究现状述评及选题的研究意义。500字左右经过一定的研究和实验验证，污泥在含盐环境中经过适当的驯化可以适应高盐环境，但是污泥驯化所需的时间过长而且有些污泥能耐受的盐度范围是有限的。盐田、盐湖中有丰富的嗜盐微生物，利用嗜盐微生物处理高盐废水是种快速有效的方法，国内外已有关于这方面的报导，而且取得了较好的效果。 Woolard CRL2利用从美国大盐湖中分离出的嗜盐菌处理盐度为1

7、15 的含酚废水。研究结果表明，酚的去除率达到99 ，出水悬浮固体质量浓度约50 mgL，低于普通污泥处理的含盐废水的出水的悬浮固体；当盐度从1突变到15时，处理系统仍能对酚进行稳定有效地去除，这可能与反应器中同时存在耐盐微生物与嗜盐微生物有关。GTShin等 用酵母菌处理泡菜生产废水，48 h后可以完全除去废·水的酸度，BOD由11 000mgL降到<3 200 mgL，去除率为70 。MHChoi等 用耐高渗透压酵母菌Pichia guilliermondiiA9处理泡菜生产废水，24 h后废水BOD 由1 210mgL降到120 mgL，去除率达到90 ；NaC1质量分数

8、为10时，A9的生长没有受到抑制。 魏呐有针对性地从长期被石油开采及炼油废水污染的土壤底泥及深井油泥中进行菌种筛选。筛选出5种优势菌，对高含盐石油废水进行处理，在废水的氯离子含量为20 gL36 L、COD浓度1 600 mgL4 000 mgL范围内，高含盐量对耐盐复合高效微生物无明显抑制作用，结合物化处理方法COD去除率稳定在90 左右，处理后废水达到二级排放标准。嗜盐菌具有较高的耐利用嗜盐菌热性和耐盐性，有些废水里不仅含有高浓度有机物还含有较高的盐度，由此可以用嗜盐菌去处理高盐度的机废水，为此进行了嗜盐菌与高盐度废水处理的研究。2、内容：研究的主要内容、主要观点、基本思路、重点及难点。5

9、00字左右一、主要内容从海水中取样，对海水进行过滤提取，培养并分离出单一菌种，并对其进行物理形态鉴定与生化特性鉴定，最后得到目的菌株。二、实验器材培养基Payne,富集培养基，二、基本思路1.样品的采集从渤海湾采集海水样品，常温下保存。2.大体步骤样品的采集富集初筛复筛分离纯化菌株的保藏菌株的形态特征和生长特性的研究究菌株的分子鉴定。菌株的生理生化研究。三、重点及难点1.由于自然界中菌株种类繁多，分离纯化很难做到完美。而纯度不高的菌株对进一步的研究会有重大的负面影响。所以在实验实施的阶段应严格控制好杂菌。样品是从海洋中提取的，则实验培养出的菌株除了嗜盐菌外一定还混有耐盐菌，因为两类菌都能耐受高

10、浓度盐液不易将它们进行分离，而实验要求必须提纯嗜盐菌才能进行后续的研究，那么实验中对嗜盐菌和耐盐菌的分离以及对嗜盐菌的纯化就成为本次创新实验的难点与重点。另外，驯化分解石油的嗜盐菌的方法还得探索，这是本实验的最难点。3、预期价值：本课题创新之处和实际应用价值。创新之处：本实验充分利用嗜盐菌来源广泛的优势，操作简单，成本低廉。将生物技术应用于海水治理领域，具有开拓性。驯化分解石油的嗜盐菌是具有经济价值和挑战性的尝试。 实际应用价值：由于采油方法、原油特性、地质条件的不同，油田采出水的水质差异较大，不少油田采出水矿化度较高，一般在1000 mgL以上，油田含盐采出废水的处理问题是油田环保工作的一个

11、重要课题。目前，含盐采出废水的处理主要有物理、化学、生物方法，但物理和化学方法具有处理不彻底，费用较高、容易造成二次污染等而难以在实际中推广，经济、高效、安全且环保的生物处理技术为这一问题的解决提供了可能。多数含盐采出废水含盐量较高，普通微生物难以适应这样的高盐环境，严重影响了其在含盐采出废水处理中的应用。因此有必要探讨在高盐环境中能降解污染物的特殊微生物，即嗜盐菌，以解决含盐采出废水的处理问题，对实现石油生产和社会经济的可持续发展具有非常重要的意义。根据渤海湾污水特性，驯化出能分解石油的嗜盐菌。4、拟采取的研究方法和技术路线包括理论分析、实验方法和步骤；研究工作的总体安排和进度。从海水中取样

12、，对海水进行过滤提取，培养并分离出单一菌种，并对其进行物理形态鉴定与生化特性鉴定，最后得到目的菌株。一、实验器材培养基Payne,富集培养基，试管，三角瓶，培养皿，烧杯，吸管，恒温水浴槽，烘箱，分光光度计，显微镜，测微尺，Ph试纸等。二、项目实施1、样品的采集从渤海湾采集海水样品，常温下保存。2、培养基的配置 (1)扩大培养基配方:牛肉膏4.0g ,酵母膏1.0g ,蛋白胨4.0g ,葡萄糖1.0g ,人工海水1000ml ,调节pH值为7.5。(2)人工海水配方: NaCl 150（25.0）g ,Na2SO4 4.0g ,KCl 0.7g ,NaHCO3 0.20g , KBr 0.10g

13、 ,H3BO3 0.03g ,NaF 0.003g ,MgCl2 5g , CaCl2 1.1g ,加蒸馏水至1000 ml ,pH 值调为7.5。灭菌完毕后，将培养基拿出，冷却。取海泥3g（3ml海水），加到富集培养基中，摇匀。37下振荡培养3天。(3)固体琼脂培养基配置：向扩大培养基配方里加入2%的琼脂粉，平均分装到两个500ml的烧杯中，用酒精灯加热，加热的同时用玻璃棒搅拌，直到溶液达到沸腾状态，撤去酒精灯，然后将溶液分别倒入几个不同的培养皿和试管中，待其冷却制成固体扩大培养基和培养基斜面。然后进行严格灭菌。 3、样品的初步处理 事先准备200ml的无菌人工海水放入烧杯，再取200ml的

14、海水，用滤纸过滤到烧杯中，然后盛放到离心管当中，以200r/s速度离心30min，倒出上清液，将全部上清液通过细菌滤器过滤，然后取下过滤膜，将其放入含有人工海水的烧杯中，使滤纸充分浸泡。用灭好菌的移液管取出1ml该溶液放入无菌的试管中，再用无菌的移液管向该试管中加入9ml无菌水，充分震荡后，再用无菌移液管取出1ml混合液放入无菌试管中，再用无菌移液管取9ml无菌水加入试管中，让其充分混合。4、富集培养 用微量注射器量取200ul混合液，将其注射到固体培养基的边缘，取出接种环，经过严格灭菌后利用“三段划线法”使其大致分散到培养基的各个部位。经过一段时间培养，会发现培养基上长满大大小小的菌斑。5、

15、分离纯化仔细观察经过培养后的培养基会发现培养基划线段的末端长出不同的单个菌落，然后用灭菌后的接种环按照无菌操作分别点取不同的菌落分划到不同的无菌斜面上，制成不同菌株的菌斜面。无菌培养若干天后得到各种菌种。6、形态观察取下不同菌落中的纯细菌，分别制成不同的载玻片，分别用显微镜观察不同载玻片下细菌的形态，再用测微尺在显微镜下测量不同细菌的直径大小。7、生化特性的测定对于不同菌斜面中的菌种分别做如下9种生化特性测定实验：糖酵解试验不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵

16、液体培养基管，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置36±1.0°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力、培养物可呈弥散生长。淀粉水解试验某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。试验方法：以1824h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区接种，试验数种培养物）或直接移种于淀粉肉汤中，于36±1°C培养2448h，或于20°

17、培养5天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸性，以pH7.2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。明胶液化试验有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。试验方法：挑取1824h待试菌培养物，以较大量穿刺接种

18、于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。于2022培养714天。明胶高层亦可培养于36±1。每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂，若为阳性，1020min后，菌落周围应出现清晰带环。否则为阴性。石蕊牛奶试验 有些微生物能水解牛奶中蛋白质酪素，酪素水解可有石蕊牛奶检测，石蕊牛奶培养基由脱脂牛奶和石蕊组成，是浑浊的蓝色。酪素水解成氨基酸和肽后培养基就会变得透明。石蕊牛奶也常用来检测乳糖发酵，有酸石蕊会转变为粉红色，过量的酸可引起牛奶的固化（凝

19、乳形成）。氨基酸分解会引起碱性反应使石蕊变为紫色。某些细菌能还原石蕊使试管底部变为白色。 试验方法：取两支石蕊牛奶培养基试管，以无菌操作分别接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌，置35恒温箱中，培养2438h。观察培养基颜色。石蕊酸性时为粉红色，碱性为紫色，还原后为无色。靛基质试验某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。试验方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36±1C培养24h时后，取约2ml培养液，加入Kovacs氏试剂23滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以

20、提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。硫化氢（H2S）试验有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。试验方法：在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中，沿管壁穿刺接种，于36±1培养2428h，培养基呈黑色为阳性。阴性应继续培养至6天。也可用醋酸铅纸条法：将待试菌接种于一般营养肉汤，再将醋酸铅纸条悬挂于培养基上空，以不会被溅湿为适度；用管塞压住置36±1培养16天。纸条变黑为阳性。V-P试验某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸

21、缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP（+）反应。试验方法：1)OMeara氏法：将试验菌接种于通用培养基，于36±1°C培养48h，培养液1ml加OMeara试剂（加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氢氧化钠水溶液）1ml，摇动试管12min，静置于室温或36±1°C恒温箱，若4h内不呈现伊红、即判定为阴性。亦有主张在4850°C水浴放置2h后判定结果者。2)Barritt氏法：将试验菌接种于通用培养基，于36±1°C

22、培养4天、培养液2.5ml先加入5°C萘酚（2-na-phthol）纯酒精溶液0.6ml,再加40%氢氧化钾水溶液0.2ml，摇动25min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±1°C恒温箱，如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。3)快速法：将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中、挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5%-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。不产酸的培养物不能使用。甲基红试验肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。试验方法：挑取新的待试纯培养物少许，