发酵工程实验报告之果汁澄清

1、发酵工程学实验组号： 7-8节第七小组 学号： 124120434 学院： 生命科学学院 专业、班级： 12生物技术 实验课程名称 发酵工程实验 指导教师及职称 唐湘华 开课学期 2014 至 2015 学年 下 学期 云南师范大学教务处编印实验名称：（一）特定产物工业生产菌种发酵及应用性质研究实验时间第十三周实验室睿智3-121小组合组是小组成员高胜全 李朝和 刘云谣 罗光洪 张志豪一、 实验目的：1、掌握菌种选育、菌种发酵条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法；2、了解酶学性质的研究.二、 实验原理：1、理论依据（1）、果胶酶概况（2）、果胶酶的酶活测定方法（3）、微生物发酵生产特定产

2、物受培养基成分、培养条件和附加条件等的制约（4）、酶催化反应的进行受多种因素的影响2、果胶酶概况果胶质：是高等植物细胞壁内及细胞壁间的结构性多糖，是一类高分子碳水化合物，它的存在往往给果蔬加工等工艺带来许多麻烦和损失。果胶酶：是指能分解果胶质的多种酶的总称，广泛存在于高等植物和微生物中。产生果胶酶的微生物：细菌、放线菌、酵母和霉菌，但目前商品果胶酶多数来自霉菌。果胶酶的应用：主要是用于果胶的分解，在水果加工、葡萄酒生产、麻类脱胶和饲料等方面有着广泛的应用。3、 果胶酶的酶活测定方法 粘度降低法：利用粘度计测量在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标准果胶溶液的粘度降低值。 脱胶作用时间法：以脱胶

3、作用的时间来测定果胶酶的酶活力。 次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活力。 还原糖法（DNS法）：测定在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，水解果胶产生的还原糖的量。 DNS法：根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，后者是一种还原糖，与3，5 -二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。4、 微生物发酵生产产品受以下条件制约：培养基成分：C源、N源、无机盐、水和生长因子培养条件：温度、pH、溶解氧等附加条件：诱导物、表面活性剂等5、酶催化反应的进行受多种因素的影响 底物浓度 酶浓度

4、温度 pH 激活剂 抑制剂三、 实验材料（一）试剂 1、酶活测定用试剂和DNS 2、新鲜果汁（二）仪器烧杯、三角瓶、试管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、试剂瓶、研钵等；天平、灭菌锅、超净工作台、培养箱、电炉、恒温水浴锅、记时器（精确到秒）、分光光度计等。（三）培养基1、菌种筛选使用2、黑曲霉Asp-2固体发酵用1、菌种筛选使用培养基 基本培养基: 果胶 1% ，磷酸氢二钠0.5%，蛋白胨1%，pH4.5，琼脂 2.0%。分离培养基果胶 0.5%，磷酸氢二钠0.5%，琼脂2.0%，pH4.5（3）发酵培养基果胶 1% ，磷酸氢二钠0.5%，蛋白胨1%，pH4.5。2、 黑曲霉Asp-2固体发酵培

5、养基菌种斜面培养基（查氏培养基） NaNO3 0.2% K2HPO4 0.1% KCl 0.05% MgSO4 0.05%FeSO4 0.001% 蔗糖 3%琼脂 2.5% 自然pH种子培养基 麸皮 3.0% ，橘子粉 2.0% ，硫酸铵0.5%,葡萄糖 1% ，KH2PO4 0.1% pH4.5固体发酵培养基：5瓶 / 组麸皮 10g，橘子粉 2.5g，(NH4)SO4 0.1g（0.8%干料计）葡萄糖 0.125g（1%干料计），水 15ml 要求：按组统一配制后分装三角瓶先将(NH4)SO4 、葡萄糖用水溶解，再加其它。四、 实验方法、步骤及注意事项：（1） 固体发酵果胶酶1、 菌种准备

6、菌种活化：试管保存菌种斜面活化30培养约60h液体培养：将菌种接种入装有50mL种子培养基的250mL三角瓶内，30，200rpm，培养约40h，备用。2、 氮源的选择和选择的氮源添加量对产酶的影响(第一组）选择硫酸铵、蛋白胨、牛肉膏按照1%浓度替换发酵培养基中的蛋白胨，接种5%液体种子，培养48小时，测定酶活。在发酵培养基中分别添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5% （按干料计）浓度的已选择的氮源，保持培养基的其它成分不变，在相同接种量（约5%，即1.5ml）相同培养条件下（30，60h）发酵，测定酶活。3、 碳源的选择和选择的碳源添加量对产酶的影响 (第二组)选择果胶、葡萄糖

7、、橘子粉按照1%浓度替换发酵培养基中的蛋白胨，接种5%液体种子，培养48小时，测定酶活。在液体发酵培养基中分别添加0、0.5%、1.0、2%、3.% 的选择的碳源，保持培养基的其它成分不变，在相同条件下接种液体种子（约5%，即1.5ml），相同培养条件下，30，发酵60h ，测定酶活。4、 培养基含水量对产酶的影响(第三组）在发酵培养基中加入蒸馏水，使培养基中的含水量分别约为50%、55%、60%、65%和70%；保持培养基的其它成分不变，在相同接种量（5% ，即1.5ml ）相同培养条件下（30，4860h）发酵，测定酶活。5、 接种量对产酶的影响 (第三组）分别以4%、5%、6%、7%和8

8、%的接种量接种果胶酶产生菌于发酵培养基中，在相同的培养条件下（30，4860h）发酵，测定酶活。注意：由于接种的是液体菌种，所以在配制培养基时要将接种时多出的水分去掉。6、 发酵时间对产酶的影响 （第四组）在相同的培养基、相同的接种量（5%，即1.5ml ）和相同培养条件下（30）分别发酵36、48、60、72和84h ，测定酶活。注意：精确计算时间，准时取出发酵产物。7、 发酵温度对产酶的影响 （第五组）保持培养基成分和接种量（5%，即1.5ml ）不变，分别在室温、30、37和45的温度条件下发酵4860h ，测定酶活。先把培养箱调到相应的温度！8、果胶酶酶活的测定（1） 待测酶液的制备烘

9、干：把发酵产物倒于平皿中，45烘干过夜；制备酶粉：将烘干的发酵产物用研钵研磨成粉状（尽量磨细），装于塑料袋中备用；制备酶液：称取0.1g酶粉，充分溶解于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（稀释100倍），纱布（4层）过滤去除杂质；如果测定所得OD值不在有效值（0.2-0.6）范围内，则相应地降低或增大稀释倍数后再进行测定。（2）果胶酶酶活测定方法OD =（A+B）/ 2酶活定义：在pH3.0、 37条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放1mol半乳糖醛酸所需要的酶量为一个酶活单位U/g。酶活计算公式 酶活（U/g）=A×5×K×N×1000/（T×W

10、×M） A: 样品的OD值 （平均值） K: 标准曲线的斜率 N: 稀释倍数 5： 0.2毫升反应液转换为1毫升体积 T: 反应时间（min） 1000：转换因子1mmol=1000mol W: 半乳糖醛酸的分子量（212.16g/mol） M: 称取酶粉克数(g)绘制标准曲线的方法先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。以A为横坐标，浓度c为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量。半乳糖醛酸标准曲线的制作 精确称取0.100

11、g半乳糖醛酸，用缓冲溶液定容至100ml，制得浓度为1mg/ml的半乳糖醛酸的标准溶液。标准曲线如下图表所示（3）注意事项试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或DNS时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头！精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；实验结果的记录与分析9、仪器的使用恒温水浴锅分光光度计烘箱移液枪UV2000型分光光度计的使用注意提前半小时接通电源，打开机器开关使仪器通电，自检；将对照液及测定液分别装入比色杯3/4体积并

12、用镜头纸擦干外壁，放入样品室；调节测定所用波长；读数完毕，打开仪器盖板，关闭开关，将比色杯冲洗干净、浸泡于30酒精中。注意事项1、接种接种方式是液体固体，用灭菌的移液管或10ml量筒接种或大枪头；接种后振荡接种瓶，使菌种充分与固体培养基混合。2、水浴锅的使用：水量（蒸馏水）要超过试管中的液面3、分光光度计使用时注意：测定OD在540nm、以对照为参比、测定吸光值4、及时清洗用过的枪头实验准备内容（1）黑曲霉Asp-2固体发酵用的培养基固体发酵培养基：5瓶/组注意配方等的不同，做好标记！（2） 灭菌培养基其它：10ml量筒（纱布和报纸包口）、移液管（塞棉花）等时间：灭菌45min注意事项1、酶粉

13、的选择：同一大组采用同一酶粉进行应用性质的实验！2、水浴锅的使用水浴锅的水量（蒸馏水）要超过试管中的液面各大组“处理时间”这项实验共同在1个水浴锅中进行3、分光光度计使用时注意OD660nm以蒸馏水为参比测定透光率五、 实验报告（一）、实验结果本次实验在菌种分离时，已经分离到能产生果胶酶的菌株，但是在后期的培养过程中，发生一点点的错误，导致培养出来的菌种没有酶活，也就是实验失败。（二）结果分析从培养的初期来看，实验能得到菌种，说明实验有成功的契机，但是在经过发酵培养之后，菌株没有酶活，也就是在发酵培养时出现意外，本次试验提醒我们做实验和做事要仔细认真，步步为营。实验名称：（二）应用发酵制备的酶

14、液进行果汁澄清的应用实验实验时间第十四周实验室睿智3-121小组合组是小组成员高胜全 李朝和 刘云谣 罗光洪 张志豪六、 实验目的：了解影响果胶酶对果汁澄清效果的各种因素七、 实验原理：1、果胶酶的应用：主要是用于果胶的分解，在水果加工、葡萄酒生产、麻类脱胶和饲料等方面有着广泛的应用。 2、脱胶作用时间法：以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。3、次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活力。4、还原糖法（DNS法）：测定在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，水解果胶产生的还原糖的量。八、 实验材料1、仪器设备：烧杯、三角瓶、试管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、试剂瓶、研钵

15、等；天平、灭菌锅、超净工作台、培养箱、电炉、恒温水浴锅、记时器（精确到秒）、分光光度计等。2、材料：新鲜果汁、NAOH溶液 、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲、DNS试剂等等。九、 实验方法、步骤及注意事项：（一）待测酶液的制备1、制备酶液：称取1g酶粉，充分溶解于10mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（稀释10倍），高速冷冻离心（10000转、5min）去除杂质；2、根据发酵条件优化实验中测定所得OD值大小，选择酶活最高的酶粉制备酶液。（二）果汁的制备1、水果清洗破碎榨汁2、稀释：用pH3.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释至10倍（三）果胶酶的应用性实验果汁澄清实验 1、果汁澄清的基本方法步骤样品A管样品 B管空

16、白管步骤1吸取稀释果汁10毫升吸取稀释果汁10毫升吸取稀释果汁10毫升步骤245保温5min45保温5min45保温5min步骤3稀释酶液1mL稀释酶液1mL不加步骤445精确保温30min45精确保温30min45精确保温30min步骤5离心（5000转，5分钟）离心（5000转，5分钟）离心（5000转，5分钟）步骤6以蒸馏水为参比，660nm测定透光率以蒸馏水为参比，660nm测定透光率以蒸馏水为参比，660nm测定透光率T（透光率） =（A+B）/ 2 TTT0空白为T02、果胶酶添加量对澄清效果的影响（1，2组）（1）在反应体系中分别加入0.2、0.5 、1.0、1.5和2.0ml的

17、果胶酶液（2）在相同的反应条件（pH3.0，45）下处理30min，以蒸馏水为参比分别测定透光率。3、果汁pH对澄清效果的影响（3，4组）（1）用0.25mol/L H2SO4 和3mol/L NaOH 分别调节果汁的pH至1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0；（2）在反应体系中加入1.0ml的果胶酶液，相同的反应条件（45）下处理30min，以蒸馏水为参比分别测定透光率。4、果汁温度对澄清效果的影响（5，6组）（1）保持反应体系的其它条件（1.0ml的果胶酶液、pH3.0，30min）不变，分别在室温（温度计测定）、37、45、 50、55条件下进行反应30Min;

18、（2）以蒸馏水为参比分别测定透光率。（四）注意事项1、水浴锅的使用（1）水浴锅的水量（蒸馏水）要超过试管中的液面（2）各大组“处理时间”这项实验共同在1个水浴锅中进行2、分光光度计使用时注意（1）OD660nm（2）以蒸馏水为参比（3）测定透光率十、 实验结果及分析1、对不同的实验组添加不同的果胶酶的量后得到的结果如下:（表一）果胶酶添加量对果汁澄清的影响酶液量（ml）OD660平均值(T)空白(TO)TTT0A管B管0.2 45.90%74.00%59.95%11.60%48.35%0.5 39.10%42.70%40.90%12.10%28.80%1.0 54.30%37.40%45.85

19、%11.40%34.45%1.5 21.80%9.30%15.55%11.90%3.65%2.0 47.30%48.90%48.10%12.00%36.10%根据上表格做出的折线图（图一）如下：【透光率之差（TTT0）】分析：根据表格数据及折线图中的信息可以看出T随着酶量的增加逐渐下降，到酶量为1.5ML时突然上升。但是根据理论分析随着酶量的增加T的值应该是逐渐上升，直到某一浓度之后不再增加。出现上图的结果说明实验没有成功，可能的原因有：（1）可能是测OD值时把管号弄混了；（2）可能是加酶时出现漏加现象；（3）从表一中A、B管数据的分布来看，该实验数据的准确性太低，波动大，可信度低。由于种种原

20、因，本次实验未能找出最适加酶量。2、不同PH的果汁对果汁澄清效果有影响的实验结果如下（表二）果汁PH对澄清效果的影响PH管号OD660平均值(T)空白管(TO)TTT01.5 A19.60%19.50%20.60%1.10%B19.10%2.0 A12.10%23.50%20.60%2.90%B35.00%2.5 A61.80%64.00%20.60%43.40%B66.10%3.0 A74.60%65.50%20.60%44.90%B66.30%3.5 A80.40%80.50%20.60%59.90%B80.80%4.0 A91.90%93.50%20.60%72.90%B95.00%4.5 A64.40%63.00%20.60%42.40%B61.80%5.0 A36.40%28.00%20.60%7.40%B20.30%根据表二做出折线图（图二）如下：【透光率之差（TTT0）】分析：从表二中的数据来看，A、B两管的数值差距不大，可信度较高，从图二可以看出随着PH的升高T不断的升高，当达到一定的高度之后，T又逐渐下降，在PH=4时T的值达到最高为72.90%。也就是说当果汁的PH=4时果汁澄清的效果最好，即