蛋白表达纯化试验步骤

1、蛋白表达纯化实验步骤（待改进）1、 取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA 。2、设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。3、 RT-PCR，KOD 酶扩增获取目的基因 c DNA.4、 双酶切，将 cDNA. 克隆入 PET28/32 等表达载体。5、转化到DH5 a感受态细菌中扩增，提质粒。6、将质粒转化入表达菌株， 挑菌检测并保种。 表达菌株如 Bl21（ DE3）、 Rosetta gam（i DE3）、BI21 codon （ DE3）等。7、蛋白的诱导表达。1）将表达菌株在3ml LB培养基中摇至 OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从2

2、5卩M 到1m M。 37度诱导过夜（一般3h以上即有大量表达）。2）SDS-PAGE 电泳检测目的蛋白的表达。注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体 蛋白的 50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。3）将有表达的菌株 10%甘油保种，保存 1ml 左右就足够了，并记录 IPTG 浓度范围。甘油是用0.22卩m过滤除菌的，储存浓度一般是30%-60%，使用时自己计算用量。4）用上述 IPTG 浓度范围的最低值诱导 10ml 表达菌， 18 度，低转速（ 140-180rpm）， 诱导过夜作为包涵体检测样品。注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加 IPTG 之前的培养基中加入 1%的

3、葡 萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2.保种可以取一部分分成 50卩l 一管，每次用一管，避免反复冻融。8、包涵体检测。方案见 附件 29、如有上清表达，则扩大摇菌。1）取保种的表达菌株先摇 10ml, 37度，300rpm摇至OD>=1.5，约5h左右，视菌种 的活性而异，也可过夜摇菌。2）将上一步中的 8ml 加入 300ml 培养基中 37 度， 250rpm 摇至 OD= 1.0 左右（约2.5h3h）,然后加IPTG （浓度同包涵体检测中使用的浓度。）注：菌液浓度要适当的浓一些，否则第二天收集不到足够的菌体，因为低温低转速细菌生长非常缓

4、慢。拿起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是，将手指放在瓶底 晃动，看不清手指为宜，不过此法宜受气泡影响。3） 过夜摇菌，使用包涵体检测的温度（18°左右），转速 140rpm 左右。4）将菌液6000rpm , 4min , 4度离心收集菌体。加入 20mM PBS，洗一遍后用平衡缓 冲液重悬。每 250ml 菌液用 30 ml 到 50ml 平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。可用4支50ml的离心管同时离心，但是，离心管要重复使用，用完后洗净保存。10 、 超声波裂解。1）用6mm变幅杆，35%功率，3.5s工作，7s休息，50min即可。注意： 1.要冰浴。 2.要

5、随时观察裂解情况以防意外。3.要将探头探入到溶液中下部，尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。4.正常声音为：孜孜声，尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头 松动等原因，要及时调整。溶液由浑浊变 清透 ，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后 面 3000 转离心时， 如果沉淀少说明裂解的好） 。 5.超声波破碎仪工作 30 分 min 要休 息5min （即关闭总电源开关）。注意 ： 1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF）， PMSF 工作浓度为 1%。 2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解60 分钟， 60 分钟足

6、够裂解。11、取得上清1）将破碎好的溶液收集到 50ml 离心管中。 10000rpm ，15min ，4°离心。沉淀为包涵 体、细胞碎片和未破碎的细胞。轻轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀。 （此时可 以测量一下 pH 值， pH 值最好在 7.5 左右。平衡 buffer 的 pH 是 7.8 左右，裂解后 上清就会在 7.5 左右。）12、纯化上清 -摸洗脱条件。1）镍柱处理。 将 1ml 镍柱吸入空层析管中， 待其中的液体流完后加入平衡缓冲液 3ml 。2）将 10ml 上清加到已经平衡过的 NI 柱上，并将过柱的样品重复上样 3 次。（若是流 速慢可以在柱子下面加一个针头，或

7、者用1ml的枪将胶体吹散。）取20卩I过柱后的样品，以备跑胶。3）分别加 20mM 、40mM 、60mM、80 mM 的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。每个梯度分别的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入 EP 管中，以备跑胶。注意 ：理论上是要将收集的溶液测量 280nm 处的吸光度，直到吸光度为零时再进行 下一个梯度的洗脱。实际上测不到零，怎么都会有一点的，上面说的量已经做够洗 脱了。4） 加Elution Buffer将目的蛋白洗脱。上样量为4.5ml （将前面的0.5ml单独接入EP 管，再将后面的 4ml 接入另外两个 EP 管），留跑胶样

8、品。5） 加MES将NI柱重生。MES加10ml，流完后再加10ml Miliq H2O。流完后保存于 2 倍体积的 20%乙醇中，镍柱至少能重复利用6 次。（尿素可能对 NI 柱有损伤。）注意 ：所有溶液使用前都要确定其pH 是否正确， pH 对挂柱及洗脱影响较大。镍柱所用溶液 MES 的 ph=5.0 ，其余 Equilibration Buffer pH=7.8 ，上清 pH=7.5 ， Wash Buffer pH=7.0 ， Elution Buffer pH=7.2 。13、跑胶验证。1）跑2块0.75mm的PAGE胶，把所有的样品都加上去，注意两块胶的浓分离比要相 同两块胶才会比

9、较一致。2）跑胶顺序：负对照、正对照、上清、过柱样品、 W1、 W2、 W3、 W4、 W5、 W6、 W7、 W8、 W9、 E1、 E2、 MES3）300V快速压胶5min左右，160V分离样品50min左右。（也可以300V,30min，只是 图没有 160V 好看。）4）考马斯亮蓝染色。一般染色 2h 即可。5）脱色。先用脱色剂1脱15min，再用脱色剂2脱过夜。14、纯化上清 -收集目的蛋白1）将重生的镍柱再次平衡（即加 Equilibration Buffer 3ml ）。2）重复步骤12中的操作，只是 wash时只用步骤12中摸好的咪唑浓度洗。15、跑胶验证。同步骤13这次胶图

10、要跑的漂亮一点（用160V），保存好。16、透析。1 ） 配制 2L 透析液（配方见附件 1 ），并放于 -20 度冰箱预冷但不要结冰。2） 透析袋（剪10cm即可）用透析袋处理液煮沸10min，用MILIQ H 2O充分洗净。3）用透析夹将透析袋夹住（将透析袋折叠一下会夹的更牢） ，将洗脱的蛋白样品加入其 中，置入提前预冷的 500ml 透析液（ 20mM PBS+50 mM NaCl ）中。冰浴下轻微磁力 搅拌 20min 后置入 4°冰箱 1.5h 后换液。透析 3 次即可。注意：用广口瓶装透析液， 将广口瓶置于装有冰的 2L 大烧杯中。 冰浴以防活性降低。17、浓缩。1） 将

11、透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中，用预冷的聚乙二醇2000固体包埋。2）30min后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除，加入新的固体聚乙二醇。3）每隔10min观察一次，一旦出现浑浊立即停止浓缩。4） 透析袋用完后，洗净，保存于20%乙醇中4°存放。注意：浓缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现，由于透析袋使溶液成薄层状， 透明度较高，不易发现小颗粒或絮状沉淀，要看仔细。如果看不到，可根据自己估 计的蛋白量留1-2ml体积。用透析液将透析袋表面的聚乙二醇洗掉，吸取其中的溶 液分装后-20度保存。18、超滤法浓缩、透析蛋白。使用超滤法就可省去16、17两步。1）将4ml Elutio

12、n得到的蛋白溶液加入超滤管中。2）配平。3）7400g, 30min，4°离心，结束时 4ml变为1ml左右。浓缩4倍。可根据需要选择不同的离心时间，以达到不同的浓缩倍数。可以几次的Elution液一起浓缩。4） 加入需要的蛋白储存液至4ml，离心。重复操作可以使 Elution液逐渐换为所需的蛋白储存液。蛋白储存液一般用20mM PBS+*mM NaCI或适当浓度和 pH的tris-HCl溶液。如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油（1%-5%即可）助溶。5） 收集。将溶液从超滤管中收集到EP管中，标记好储存液的成分，蛋白名称，蛋白 浓度（测量后），制备日期。注：超滤管的使

13、用方法见附件 419、蛋白浓度测定。见附件 320、蛋白活性测试。转染细胞测量荧光。21、抗原处理。蛋白与弗氏佐剂混合成油包水状。22、注射兔子。选择合适的注射方式和合适的免疫程序。23、收集免疫血清。提取抗体。24、抗体效价评定。附件1所需溶液配方：1） 20 mM PBS: 20 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl pH 7.4试剂名称NaH2PO4-2H2ONa2HPO4-12H2ONaCl用量（g）1L0. 59285.80219217.5322）Equilibrati on Buffer （平衡缓冲液）：PBS with 10 mM 咪唑 pH 7.43

14、）Wash Buffer （清洗缓冲液）：PBS with 25 mM/50 mM/75 mM 咪唑 pH 7.44）Elution Buffer （洗脱缓冲液）：PBS with 250 mM 咪唑 pH 7.45）MES （再生缓冲液）：20 mM 2-（N-morpholine）-ethanesulfonic acid, 0.1 M sodiumchloride; pH 5.0。即 0.3904g MES+0.5844g NaCl.6）透析袋处理液：2%（ w/v）碳酸氢钠和1 mmol/L （pH8.0） EDTA7）透析液：20mM PBS+50 mM NaCl （ 2.92g）试剂

15、名称NaH2PO4-2H2ONa2HPO4-12H2ONaCl用量（g） 1L0. 59285.8021922.92gTIPS:1 4的溶液可以一起配制。先配10ml 8M的咪唑。再配1L的PBS，用500ml水将 试剂溶解，取两个 50ml和一个150ml分别加到两个100ml瓶子和一个500ml瓶子中，作为Wash Buffer、Elution Buffer 和 Equilibration Buffer，再向其分别加入适当体积的 8M 咪唑。 最后，定容。Wash Buffer、Elution Buffer 各配了 100ml， Equilibration Buffer 配了 300ml。

16、 PBS 配了 500ml。附件2包涵体检测1. 摇10ml菌，力口 0.5%葡萄糖和相应抗性。培养至0D600=0.5后离心加入新的培养基和相应浓度的IPTG低温（16-25度）诱导过夜（也可不离心，在原来LB中直接加IPTG）。在 离心前取500卩l菌液作为负对照，诱导完成后取500微升作为正对照。正负对照不用超声波裂解，直接煮沸10min跑胶。2. 诱导完成后，用 2ml EP 管 6000rpm, 2min, 4 度，收集 10ml 菌液。1.5ml PBS （50m M PBS,300m M NaCl ）重悬细菌。3. 裂解细胞。用超声波破碎细胞直到悬液变清亮，一般15到30min。

17、裂解3s,停止6s,裂解时冰上放置。4. 分离上清。5000rpm , 4min , 4°除去未裂解的细菌和大的细菌碎片。然后，10000rpm ,10min , 4度。取上清于新的1.5mlEP管中。取其中的20微升于200微的EP管中，加5 微 5*SDS loading buffer 混匀，煮沸 10min。5. 重悬包涵体。 用1000微PBS震荡重悬包涵体，取20微于200微的EP管中加5微5*SDSloading buffer，煮沸 10min。6. 正负对照的收集。离心收集正负对照菌体，0.5ml上清留下40卩I,加入10卩l5*SDSIoading buffer,煮沸

18、 10min 裂解。7. 跑聚丙烯酰胺凝胶。将正负对照及实验样品一起跑胶。一般顺序是：-,+,上清,包涵体.附件3蛋白浓度定量测试方案1.将染色剂稀释。稀释5倍，取4ml染色剂于50ml离心管中，加16ml miliq H 2O.充分溶解后用 0.44卩m的滤膜过滤于另 50ml离心管中。（此剂量可测4个样品。）2牛血清白蛋白（BSA）标准品的制备1 ）将冻干的BSA溶于去离子水中，溶解成浓度为1mg/ml，分装为400-500卩1/支（可以室温放置60天，-20度长期保存）。2）将1mg/ml的BSA分别稀释成 0.2、0.4、0.6、0.8mg/ml，各180卩l，另外加一管水为零对照。浓

19、度0.2mg/ml0.4 mg/ml0.6 mg/ml0.8 mg/mlBSA (1mg)36卩l72卩l108 卩 l144 卩 lH2O144 卩 l108 卩 l72卩l36卩l3. 染色。1 ）取1.5ml已过滤的染色剂分别加入13支（其中4支为待测样品）1.5mlEP管中。4个梯度各做一个重复，共 8支，另外加1个样品（或 1+n个样品）和1个blank，共10支 EP管（或10+n支），分别对应标记。2）将30卩l样品和30卩l标准BSA及30卩l H2O分别加入上述 EP管中。涡旋混匀。3） 室温孵育5min到60min。 5min后即开始测量，在 60min内测完，越快越好，因

20、为Absorba nee wil in crease over time。4吸光度的测量。600nm处测量，并记录吸光度。注意：1. blank是染色液加30微升的水。2从低浓度测量到高浓度。根据混合液的颜色大致判断sample的浓度范围，据此决定sample的测量顺序。5比色皿的洗涤。用100%乙醇浸泡洗涤。6.标准曲线的制作。 利用excel工具取标准品的平均值制作线性回归标准曲线。附件4.4ml millipore超滤离心管使用注意事项1. 用前用miliq水润湿。2. 4度预冷。3. 离心力不能超过 7500g。加速度设定为 8.4. 离心时将离心管的两膜片竖直到与地面垂直的角度后开始

21、离心，以使两膜所受的压力一致。5. 使用完毕后，用 miliq水洗净，加入1ml 0.1N NaOH泡24h，后加入1ml20%乙醇保存。 如果要短期保存几天，也可加水浸泡。附件5聚丙烯酰胺凝胶的制备及使用方法附件6.包涵体蛋白的提纯与提上清中所用试剂不同之处：在Equilibration Buffer、Wash Buffer、Elution Buffer中各加了 6M尿素或盐酸胍。尿素或盐酸胍用来溶解包涵体蛋白。在裂解完后，离心时先 3000rpm3min去除未裂解的细胞和大的碎片，再10000rpm15min离心，沉淀就是包涵体。用加了 6M尿素或盐酸瓜的 Equilibration Buffer溶解包涵体。后面的步骤跟提上清蛋白一致， 只是所用 Equilibration