鼠源抗过敏融合蛋白的瞬时表达及纯化

1、华 东 理 工 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版)j o ur nal of ea st chi na u niver sit y of science a nd technolo gy ( nat ural science editio n)vol . 37 no . 52011210532文章编号 :100623080 (2011) 0520532206鼠源抗过敏融合蛋白的瞬时表达及纯化程露1 ,易小萍1 ,孙祥明2 ,张元兴1(1 . 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 , 上海 200237 ;2 . 上海富莼科芯生物技术有限公司 ,上海 201203)摘要 :采用流加和降

2、温培养工艺 ,实现在 5 l 搅拌式生物反应器规模的瞬时基因表达 。首先比较了两种表达载体在 c ho2s 细胞中的瞬时基因表达 ,发现 p id2ma a f p 载体介导的瞬时转染表 达可以获得 ma a f p 的高水平表达 。采用 p id2ma a f p 载体在 1 . 3 l 搅拌式生物反应器中进行瞬 时基因表达 ,与分批培养相比 ,通过流加和降温培养工艺对转染过程进行控制 ,培养时间延长 1 倍 , 蛋白表达浓度提高 8 倍 。在 5 l 搅拌式生物反应器中对上述工艺进行成功放大 , ma a f p 质量浓 度达到 25 mg/ l 。之后 , 利用 r pro t ei n

3、 a sep ha ro se fa st flo w 介质纯化 ma a f p , 并通过 sd s2pa ge 、we st e r n blo t 验证其纯度 ,为下一步利用小鼠模型研究蛋白功效和作用机理做好准备 。关键词 :融合蛋白 ; 瞬时基因表达 ; 中国仓鼠卵巢细胞 ; 过敏中图分类号 : q78文献标志码 : aexpression and purif ication of a mouse2derivedanti2allergy fusion proteintransient genec h e n g l u 1 ,( 1 . s t ate ke y l abo r at

4、 o r y o fy i x i ao2p i n g 1 ,s u n x i a n g2m i n g 2 ,z h a n g y u a n2x i n g 1b i o re act o r e n g i nee ri n g , e as t ch i n a u ni v e rs i t y o f s ci e nce a n d t ec h nol o g y ,s h a n g h ai 200237 , c hi n a ; 2 . s h a n g h ai f uc h u n ke x i n b i ot ec h co . , l t d , s

5、h a n g h ai 201203 , c hi n a)abstract : to i mp ro ve t he t ra n sie nt ge ne e xp re ssio n of a mo u se2derived a nti2alle r gy f u sio n p ro t ei n( ma a f p) i n 5 l bio reacto r , f eedi ng a nd mil d hypo t he r mia were a dop t ed to get he r to p ro vi de sufficie nt nut ritio n fo r cel

6、l gro wt h a nd e xt e nd t he p ro ductio n duratio n . fi r st l y , t wo diff e re nt e xp re ssio n vecto r s of p c i2ma a f p a nd p id2ma a f p we re t ra n sie nt l y t ra n sf ect ed i n c ho2s cell s wit h a n op ti mal t ra n sie nt t ra n sf ectio n p ro tocol a nd a bet t er level of ma

7、 a f p e xp re ssio n wa s reac hed w he n u si ng p id2ma a f p a s a n e xp re ssio n vecto r . tra n sie nt ge ne e xp re ssio n ( t ge) wa s co nduct ed i n 1 . 3 l bio reacto r , wit h co mbi ne d u se of f ed2bat c h a nd mil d hypo t her mic cult ure , so t he e xp re ssio n level of ma a f p

8、 wa s i ncrea se d 82fol d co mp a re d wit h bat ch c ult ure . fi nall y , t he t ge p roce ss wa s ca r ried o ut i n a 5 l bio reacto r a nd a hi gh e xp re ssio n level of 25 mg/ l wa s achieved. ma a f p wa s sub seque nt l y p urifie d by r pro t ei na sep ha ro se fa st flo w . the o bt ai n

9、e d ma a f p wa s i de ntifie d by sd s2pa ge a nd we st e r n blo t . thi s wo r k p ro vided t he nece ssa r y ba si s to a ssa y ma a f p efficacy i n mo u se lat e r o n .key words : f u sio n p ro t ei n ; t ra n sie nt ge ne e xp re ssio n ; chi ne se ha mst er o va r y ( c ho) cell s ; aller

10、gy收稿日期 :2011202220基金项目 :国家反应器重点实验室开放课题基金 ( 2009 zx09503201322) ;国家科技重大专项 ( 2009 zx091022249) 作者简介 :程 露 ( 19842) ,女 ,浙江衢州人 ,博士生 ,研究方向为动物细胞培养 。e2mail : rai n7166 si na . co m 通讯联系人 :易小萍 , e2mail : xp yi ecust . edu . cn抗过敏融合蛋白 ( a nti2alle r gy f u sio n p ro t ei n ,a a f p) 由人源的 fc和 fc构成 ,可以交联肥大细 胞和

11、嗜碱 粒细 胞 表面 介导 过敏 反 应 的 fc受 体 i ( fcr i) 和抑制性 fc受体 iib ( fcr iib) ,抑制肥大 细胞和嗜碱粒细胞的活化及过敏炎性介质的释放 , 从 而 阻 断 过 敏 的 发 生 122 。受 体 的 特 异 性 决 定 a a f p 只作用于人的细胞 ,这就限制了临床前研究a a f p 的功能和作用机理的材料来源 。目前 ,临床 前实验通常会利用动物模型研究蛋白药物的功效 、 作用机理以及对机体有无毒性 ,为后期的临床实验 奠定基础 ,尤其是小鼠模型的应用 。但是利用小鼠 作动物模型研究 a a f p 的抗过敏作用机理 ,不能直接使用人源化

12、的 a a f p ,而要使用鼠源的抗过敏融 合蛋白 ( mo u se2de rived a nti2aller gy f u sio n p ro t ei n , ma a f p) 。本文利用瞬时基因表达 ( tra n sie nt ge ne e xp re ssio n , t ge) 技术 ,大量制备了 ma a f p ,为后 期利用小鼠进行抗过敏蛋白的前期开发研究打下了基础 。t ge 能够快速制备蛋白样品 ,广泛应用于蛋白 药物的前期开发阶段 。t ge 过程复杂 ,许多因素都 可以影响其转染效率和目标蛋白的产率 ,如宿主细 胞 、表达载体和转染过程等等 。t ge 的宿

13、主细胞主要有 co s27 ( af rica n gree n mo nkey ki dney) 细胞 3 , h e k2293 ( h uma n e mbr yo nic ki dney) 细胞 4 , c ho ( chi ne se ha mst er o va r y ) 细 胞 5 和 b h k ( ba byha mst er ki dney) 细胞 6 。目前 ,大部分动物细胞表 达的蛋白药物都是在 c ho 细胞中生产的 7 , 采用c ho 细胞作为 t ge 的宿主细胞 ,可以确保前期研 发样品与最后临床应用产品在分子结构上的一致性 (如糖基化等) 。因此 , c

14、ho 细胞已经成为 t ge 中 最主要的宿主细胞 。t ge 中 ,启动子的效率和进入 细胞的质粒拷贝数对蛋白的产率都很关键 。通常希望使用具有较高转录活性的启动子提高蛋白的表 达 。然而 ,启动子的效率与宿主细胞也直接相关 ,刘 文军 等 8 曾 报 道 在 c ho 细 胞 瞬 时 表 达 系 统 中 , cmv 加强型启动子较 sv40 早期启动子及 l r t 的 转录活性强 ,前者分别是后两者的 10 倍和 30 倍左右 ,因此 , 在 c ho 细 胞 的 t ge 中 , 使 用增 强 型 的 cmv 启动 子 可 以 获 得 更 高 的 蛋 白 产 率 。此 外 , t ge

15、 的蛋白产量不仅受转染效率的影响 ,也依赖于 转染后培养过程的有效控制 。通过优化瞬时转染过 程中的温度 、培养基等条件 ,可以有效地改善 t ge的表达产量 9 。本实验将针对 ma a f p 的特性 ,选 择合适的表达载体及转染后的培养策略 ,提高瞬时 转染的表达产量 。本文采用 c ho2s 细胞无血清瞬时转染系统表达 ma a f p 。通 过 培 养 基 的 流 加 和 培 养 温 度 的 降 低 ,延长转染后的生产周期 , 从而提高 ma a f p 的 表达产量 ; 并建立了基于 pro t ei n a 亲和层析的纯 化工艺 , 制备高纯度 ma a f p 样品 , 以便应

16、用于小 鼠体内的功能和机理研究 。1 材料与方法1 . 1材料1 . 1 . 1菌株 、质粒和宿主细胞宿主细胞 c ho2s购自 invit ro ge n 公司 ;大肠杆菌 to p 10 、载体 p c i2neo 及 p id 为本实验室保存 。cda gt2c ho 培 养基 购于1 . 1 . 2培养 基 和试 剂gib co 公司 ; p f2c ho 培养基购于 hyclo ne 公司 ;li nea r 25 kda pol yet hyle ni mi ne ( p ei) 购 于 pol y2scie nce s 公司 ; 限制性内切酶 ecor i 、s al i , d

17、n a 连 接试剂购于宝生物工程 ( 大连) 有限公司 ; ta q dn apol ymera se ,dn a ma r ker iii ,2hi nd iii ,质粒抽提试剂盒 ,小量凝胶回收试剂盒购于上海天根生物工 程有限公司 。1 . 2方法1 . 2 . 1载体 p c i2ma a f p 和 p id2ma a f p 的构建ma a f p 由 fc和 hi nge2fc 组 成 , 根 据 ge n2ba nk 提供的序列 ( id : j 00476 . 1 , id : l 27437 . 1) 设 计 ma a f p 的基因序列 ,由捷瑞生物有限公司合成并 克 隆

18、到 载 体 p c i2neo 中 , 命 名 为 p c i2ma a f p 。p id 来源于质粒 p ir es ( clo nt ech ) , 是将中国仓鼠的二氢叶酸还原酶 (d h f r) 基因插入到多克隆位点 b 的 x bai 和 s a l i 之间得到的 ,由于本文所用的表 达系统不涉及 d h f r 的扩增表达 , 故在构建 p id2 ma a f p 表达载体时将 d h f r 基因一同切除后再插入 ma a f p 。载体 p ci2ma a f p 用 ecor i 和 s al i 进行双酶切 ,回收的 ma a f p 片段与同样双酶切的 表达载体 p

19、 id 连接转化 to p 10 ,37 °c 培养箱培养 过夜后 , 随 机 挑 取 克 隆 , 小 剂 量 制 备 质 粒 , 并 用 ecor i 和 s al i 进 行 双 酶 切 , 经 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 鉴定 ,将鉴定正确的重组质粒送上海桑尼生物有限公 司测序 。c ho2s 细胞的培养1 . 2 . 2从细胞库中取出的c ho2s 细胞 在 含有 20 ml cda gt2c ho 培养 基的125 ml 摇 瓶 中 培 养 , 摇 床 转 速 120 r/ mi n , 置 于37 °c ,= 5 % co2 培养箱内 。细胞每隔 48 h 进行

20、稀释传代 , 接种密度为 1 ×106 cell s/ ml , 转染时保证细胞存活率在 95 %以上 。534华 东 理 工 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版)第 37 卷1 . 2 . 3 c ho2s 细胞的转染 6 孔板内表达载体的选择 :将 c ho2s 细胞用 cda gt2c ho 培养基稀释到2 ×106 cell s/ ml ,以每孔 1 ml 加入到 6 孔板中 ,而 后加入 8 g dn a 与 20 g p ei 形成的 dn a2p ei复合物 ,孔板置于 37 °c ,= 5 % co2 的培养箱内 ,摇床上培养 , 摇床转速为

21、125 r/ mi n 。6 h 后 , 每孔 加入 1 ml p f2c ho 培养基 。72 h 后 , 1 000 r/ mi n离心 5 mi n 收集上清检测蛋白浓度 。1 . 3 l 和 5 l 搅拌式生物反应器瞬时转染时 , 所有 dn a 和 p ei 用量同比例增大 ,并在转染后期 进行培养基流加及降温培养 。5 l 反应器内搅拌速 率控制在 100 r/ mi n ,p h 控制在 7 . 0 ,培养温度控制在 37 °c ,溶解氧饱和度控制在 50 %以内 。根据葡 萄糖消耗速率调节流加速率 ,维持葡萄糖质量浓度 在 1 2 g/ l 。当 细 胞 密 度 达

22、到 6 ×106 cell s/ ml 时 ,将培养温度缓慢降至 32 °c 继续培养 。从转染 开始后每隔 24 h 取样一次 ,直至细胞存活率降至一半左右结束培养 。1 . 2 . 4 纯化介质的选择 柱高 5 c m 、直径 1 cm 的 r pro t ei n a sep ha ro se f sat flo w 与 r pro t ei n a st rea mli ne 柱子 ,用平衡液 (20 mmol/ l 磷酸盐缓冲 液 ,p h 7 . 0) 平衡至纯化体系的基线稳定后 ,将离心并过滤的细胞培养上清液以 2 ml / mi n 的速 率上 样 ,再用平

23、衡液平衡柱子至所有未结合组分流出 ,基 线稳定后用洗脱液 ( 0 . 1 mol/ l 柠檬酸 ,p h 3 . 0) 以1 ml / mi n 的速率洗脱 ,收集洗脱峰 。体系的基线稳定 ,再将离心并过滤的细胞培养上清液以 2 ml / mi n 的速率上样 ,而后再用平衡液平衡 柱子至所有未结合组分流出 ,基线稳定后分别用不 同 p h (3 . 0 ,4 . 0) 的 0 . 1 mol/ l 柠檬酸洗脱液洗脱 , 收集洗脱峰 。1 . 2 . 6 ma a f p 的浓度检测 采用 eli sa 双抗夹心 法检测培养上清中的 ma a f p 浓度 。以 羊抗 小鼠ig g 包板 ,捕

24、获培养上清中的 ma a f p ;以羊抗小鼠 ig g fc2h r p 酶标抗体显色 , 于酶标仪上 检测 450 n m 的 od 值 。1 . 2 . 7 数据统计学分析 实验数据分析采用统计 学方法 。两种表达载体的比较及反应器中 3 种不同培养模式条件比较的实验数据每组均重复了 3 次 , 而后进行 t 检验 , p 值小于 0 . 05 被视为具有显著性 差异 。2 结果与分析2 . 1 重组载体的构建载体 p c i2ma a f p 及 p id 进行双酶切 , 经质量 分数为 1 . 0 %的琼脂糖电泳鉴定 , 结果得到 1 740 bp 的 ma a f p 条带和 5

25、460 bp 的 p id 载体条带 ,与理论值相符 ,见图 1 (a) 。将回收的 ma a f p 片段与 p id 连接构建重组质粒 p id2ma a f p , 双酶切 后经 琼脂糖凝胶电泳鉴定正确 ,见图 1 ( b) 。测序结果与 ge nba n k 中的基因序列完全一致 ,且正向插入载体 p id 中 。ma a f p 洗 脱 条 件 的 优 化1 . 2 . 5r pro t ei n asep ha ro se fa st flo w 柱子先用平衡液平衡至纯化a : 1 dn a mar ker iii , 2 p ci2ma a f p di ge st ed by

26、ecor i a nd s al i , 3 p id dige st ed by ecor i and s al i , 4 2hi nd iii ;b : 1 - 2hi nd iii , 2 p id2ma a f p vecto r , 3 p id2ma a f p dige st ed by ecor i a nd s al i , 4 dn a ma r ker iii图 1 重组表达载体双酶切电泳图fig. 1 re st rictio n map of reco mbi na nt pla smid2 . 2pci2maafp 和 p id2maafp 瞬时转染的比较分别将载

27、体 p c i2ma a f p 和 p id2ma a f p 在不 同 dn a2p ei 配比 下瞬 时 转 染 c ho2s 细 胞 , dn a用量均为 8 g 。转染后培养 72 h 离心收集上清 ,检测上 清 中 蛋 白 的 产 量 。从 图 2 的 结 果 可 以 看 出 , dn a 与 p ei 质量比为 1 2 时 ,蛋白的表达量最高 ,且载 体 p id2ma a f p 的 表 达 量 比 p c i2ma a f p 高63 % ,两者存在显著性差异 。故采 用 p id2ma a f p应用于后续的转染实验 。2 . 3搅拌式生物反应器中的瞬时转染表达本文在 1

28、. 3 l 搅拌式生物反应器中比较了分批 培养与流加降温培养对瞬时转染过程的影响结果 , 结果见表 1 ,从表中可以看出 ,转染后采用流加降温 培养 ,不仅细胞密度增加了 1 . 6 倍 ,培养时间也从 5 d 延长至 11 d ,最终蛋白浓度提高 8 倍 。在 5 l 搅 拌式生物反应器中对上述瞬时转染工艺进行成功放大 ,结果见图 3 ,ma a f p 浓度达到 25 mg/ l 。2 . 4maafp 的纯化与验证2 . 4 . 1r pro t ei n a sep ha ro se fa st flo w 与 r pro2t ei n a st rea mli ne 介质的选择ma

29、a f p 是 2 种免疫球蛋白 fc 段组成的融合蛋白 ,由 580 个氨基酸组 成 ,理论蛋白相对分子质量为 68 k pa 。离心收集的培 养 上 清 液 分 别 经 过 已 平 衡 的 r pro t ei n a sep ha2ro se fa st flo w 与 r pro t ei n a st rea mli ne 柱 ,用洗脱图 2fig. 2两种载体在不同 dn a2p ei 配比条件下的转染比较tra nsient t ra nsf ectio n wit h p ci2ma a f p a nd p id2ma a f p at diff erent ma ss ra

30、tio s of dna and p ei- ma a f p ; - cell den sit y ; - viabilit y ; - re sidual gl uco se图 3 5 l 搅拌式生物反应器的瞬时转染表达fig. 3 tra nsient t ra nsf ectio n in 5 l bio reacto r出 ,蛋白多以二聚体的形式分泌在胞外 。经 r pro2t ei n a st rea mli ne 柱纯化的样品 ,上样量加大后 ,有 明显的杂蛋白条带显示 。相比之下 , 经 r pro t ei n a sep ha ro se fa st flo w 柱纯化的

31、样品 ,在上样量加大 后杂 蛋白 条带 较 少 , 故选 择 r pro t ei n a sep ha ro sefa st flo w 介质纯化 ma a f p 。还原型 sd s2pa ge 电泳结果见图 4 ( b) ,可以看出 ,洗脱蛋白的大小与 理论值相符 。表 1 1 . 3 l 搅拌式生物反应器中分批培养与流加降温培养对瞬时转染的影响table 1tra nsient t ra nsf ectio n in 1 . 3 l bio reacto r wit hbatch cult ure a nd hypo t her mic f ed2batch cult uremaa f

32、p/( mg ·l - 1 )cell den sit y/( 10 6 cell s ·ml - 1 )t/ d2 . 2 ±0 . 64 . 0 ±0 . 25 ±0 . 6bat ch cult urehypo t her mic f ed2bat ch cult ure19 . 9 ±36 . 4 ±0 . 310 ±0 . 62 . 4 . 2ma a f p 洗脱条件的优化为得到高纯度的 ma a f p 用于动物实验 ,将培养上清经过平衡后的 r pro t ei n a sep ha ro se f

33、a st flo w 柱 ,分别用 p h4 . 0 和 p h 3 . 0 的 0 . 1 mol/ l 柠檬酸洗脱液进行洗 脱 ,收集的洗脱峰进行 sd s2pa ge 电泳 , 结果见图5 。在图 5 (a) 中 ,2 号样品是用 p h 4 . 0 的柠檬酸洗 脱优化 ,3 号样品是用 p h 3 . 0 的洗脱液进行洗脱优化 ,由此可以看出 ,在 p h 4 . 0 的 0 . 1 mol/ l 洗脱液 条件下收集的洗脱峰几乎没有杂蛋白条带 ,获得的 蛋白纯度高达 98 % ,完全符合后期的小鼠体内实验液 ( 0 . 1 mol/ l 柠檬酸 ,p h 3 . 0) 进行洗脱 ,收集

34、整个洗脱峰 ,并及时加入 tri s 缓冲液 , 调整至中性 。将 洗脱的样品以不同的上样量进行 sd s2pa ge 电泳 ,结果如图 4 所示 。其中 ,26 号的样品进样量分别 为 15 、20 、5 、1 、10 g ,所用柱子为 r pro t ei n a st re2a mli ne ; 710 号的样品进样量分别为 10 、10 、15 、5g ;所用柱 子 为 r pro t ei n a sep ha ro se fa st flo w 。 图 4 (a ) 为非还原 sd s2pa ge 电泳 , 由图中可以看536华 东 理 工 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版)

35、第 37 卷的要求 ,且纯化回收效率达到了 85 %以上 。将纯化后的蛋 白 进 行 了 we st e r n blo t 分 析 , 结 果 见 图 5 ( b) ,由图看出 , 68 kda 左右可见清晰的条带 ,说明 瞬时表达的 ma a f p 具有良好的特异性 。讨论3本文采用 c ho2s 细胞无血清瞬时转染系统表达 ma f f p 。为获取高蛋白产量 , 首先在表达载体 水平进行比较 ,选择高产的 p id2ma a f p 作为表达 载体 。值得注意的是 ,实验中所用的两种载体 ,p c i2ma a f p 和 p id2ma a f p 的启动子序列以及内含子 序列都是

36、相同的 , 但是在 c ho2s 细胞中的表达效 果却存在着明显的差异 ,具体原因还有待进一步的 研究 。流加培养广泛应用于动物细胞培养生产重组蛋白药物 。流加培养过程中 ,通过对营养物供给的控 制 ,确保细胞生长需要的同时避免过量累积 ,并且改 善细胞的生理状态并提高蛋白产量 。在 c ho 细胞 的瞬时转染体系中 ,流加培养策略被认为对提高目 标蛋白产量没有显著的效果 10211 。但是 ,通过更新培养基或者控制培养条件 , gal brait h 等 9 成功地延 长转染后的 c ho 细胞培养时间 , 使重组抗体的生 产持续至 21 天 。这些结果表明延长 c ho 细胞的 培养时间对

37、蛋白产量的提高具有重要的意义 。动物 细胞反应器培养过程中 , 培养温度一般控制 在 37°c ,但是降低培养温度多次被报道可以提高重组蛋 白在一些细胞系中的表达 12214 。在反应器瞬时转染 过程中 ,本研究同时采用流加和低温培养策略 ,在维 持细胞高密度生长的同时 ,也保证目标蛋白的持续 生产 ,最终成功地在 5 l 反应器中实现 ma a f p 蛋白的瞬时基因表达 ,蛋白浓度达到 25 mg/ l 。这一 结果表明 ,在 c ho 细胞的瞬时表达系统中 ,转染后 培养调控可以明显提高蛋白的产量 。目前 ,大约 70 %80 %的抗体及 fc 融合蛋白( a) no n2re

38、duci ng sds2pa ge( b) reduci ng sds2pa ge1 : ma r ker ; 26 : ma a f p purified by r proei n a st rea mli ne ( 15 , 20 ,5 ,1 ,10 g) ; 7 10 : ma a f p purified by r pro t ei n a sop haro se fa stflo w ( 10 ,10 ,15 ,5 g)图 4 ma a f p 经 r pro tein a sep ha ro se fa st flo w 与 r pro2tein a st reamline 纯化的

39、 sds2pa ge 分析fig. 4sds2pa ge a ssay of ma a f p p urified by r pro tein asep ha ro se fa st flo w a nd r pro tein a st rea mline的纯 化 使 用 pro t ei n a 、pro t ei n g 亲 和 层 析 15 。( a)pro t ei n a 含有 5 个可以和抗体 fc 段特异性结合的结构域 ,当作为亲和配基被偶联到琼脂糖基质上 ,可 以特异性与样品中的 fc 分子结合 ,使其他杂蛋白流 穿 。虽然 pro t ei n a 能与 ig g 的 fc

40、段特异性结合 , 但是仍有许多因素会影响分离纯化的效果 ,如缓冲液 、离子强度 、p h 等 , 因此选择合适的缓冲液 、p h 和离子强度是必要的 。本实验比较了两种 p h 的柠 檬酸溶 液 对 ma a f p 的 洗 脱 效 果 , 结 果 表 明 两 种 p h 下 ma a f p 均能被洗脱 ,但是发现在 p h 3 . 0 的 洗脱条件 下 一些 杂蛋 白与 pro t ei n a 结 合能 力 较弱 ,被同时洗脱 ,影响了 ma a f p 的纯度 ,因此本实 验选择 p h 4 . 0 的柠檬酸溶液洗脱 ma a f p 。此外 , 在洗脱后收集到的纯化样品中及时加入了

41、tri s 缓( b)图 5 ma a f p 蛋白 洗脱条件的优化 ( a ) 及其 we ster n bolt验证 ( b)fig. 5 diff erent el uting co nditio ns ( a )ma a f p ( b)and wester n bolt ofdr ug deliver y review s , 2006 , 58 : 6712685 .刘文军 ,杨芙蓉 , 阮力 ,等. 三种病毒启动子在中国地鼠卵巢( c ho) 细胞中表达活性的比较j . 病毒学报 , 1997 , 13 ( 2) :1642168 .gal brait h d j , tait

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