细胞破碎分离学习教案

1、会计学1第一页，共50页。2第1页/共50页第二页，共50页。3第2页/共50页第三页，共50页。4组成成分：组成成分：肽聚糖（肽聚糖（peptidoglycanpeptidoglycan）: :主要成分组，它是难溶性的聚糖主要成分组，它是难溶性的聚糖链；相邻聚糖链上的短肽又交叉相联，构成了细胞壁的三链；相邻聚糖链上的短肽又交叉相联，构成了细胞壁的三维网状结构，包围维网状结构，包围(bowi)(bowi)在细胞周围；在细胞周围；氨基酸：氨基酸：D,L-D,L-丙氨酸；丙氨酸；D-D-谷氨酸；谷氨酸；L-L-赖氨酸赖氨酸磷壁酸：醛糖磷酸酯的聚合物；仅在革兰氏阳性菌中存在；磷壁酸：醛糖磷酸酯的聚合

2、物；仅在革兰氏阳性菌中存在；糖：葡萄糖，半乳糖，甘露糖等糖：葡萄糖，半乳糖，甘露糖等脂质：不多，仅在于革兰氏阴性菌中脂质：不多，仅在于革兰氏阴性菌中破碎细菌的主要阻力：是来自于肽聚糖的网状结构。破碎细菌的主要阻力：是来自于肽聚糖的网状结构。第3页/共50页第四页，共50页。5第4页/共50页第五页，共50页。6第5页/共50页第六页，共50页。7u葡聚糖：它构成了细胞壁的骨葡聚糖：它构成了细胞壁的骨架，使细胞具有一定的形状；架，使细胞具有一定的形状；最里层。最里层。u糖蛋白糖蛋白: :在葡聚糖上面在葡聚糖上面u甘露聚糖：最外层甘露聚糖：最外层(wi cn)(wi cn)。由。由1,6-1,6-

3、磷酸二酯键连接成网磷酸二酯键连接成网状。在内部有甘露聚糖状。在内部有甘露聚糖- -酶的复酶的复合物。合物。u破碎酵母细胞壁的阻力：主要破碎酵母细胞壁的阻力：主要决定于壁结构交联的紧密程度决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。和它的厚度。第6页/共50页第七页，共50页。8第7页/共50页第八页，共50页。9真菌真菌(zhnjn)(zhnjn)细胞壁的结构示意图细胞壁的结构示意图l真菌细胞壁的强度：主要决定于聚合物的网状结真菌细胞壁的强度：主要决定于聚合物的网状结构，不仅如此，它还含有构，不仅如此，它还含有(hn yu)(hn yu)几丁质或纤维几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度更高。素的纤维

4、状结构，所以强度更高。第8页/共50页第九页，共50页。10微生微生物物革兰氏革兰氏阳性细菌阳性细菌革兰氏革兰氏阴性细菌阴性细菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层主要主要组成组成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30-4

5、0%)(30-40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白质蛋白质(6-8%)(6-8%)脂类脂类(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂类脂类蛋白质蛋白质微生微生物物革兰氏革兰氏阳性细菌阳性细菌革兰氏革兰氏阴性细菌阴性细菌酵母菌酵母菌真菌真菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm层次层次单层单层多层多层多层多层多层多层主要主要组成组成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白质蛋白质脂多糖脂多糖(1-4%)(

6、1-4%)肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白质蛋白质葡聚糖葡聚糖(30-40%)(30-40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白质蛋白质(6-8%)(6-8%)脂类脂类(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂类脂类蛋白质蛋白质4. 4. 微生物不同细胞壁的组成微生物不同细胞壁的组成(z chn)(z chn)和结构和结构第9页/共50页第十页，共50页。11第10页/共50页第十一页，共50页。12第11页/共50页第十二页，共50页。13第12页/共50页第十

7、三页，共50页。14木质素的网状结构显微镜图木质素的网状结构显微镜图纤维素纤维素半纤维素半纤维素第13页/共50页第十四页，共50页。15分分 类类作作 用用 机机 理理适适 应应 性性机机械械法法研磨法研磨法固体剪切作用固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作；可达较高破碎率，可较大规模操作；大分大分子目的产物易失活，浆液分离困难子目的产物易失活，浆液分离困难高压匀浆法高压匀浆法液体剪切作用液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，可达较高破碎率，可大规模操作，不适合不适合丝状菌和革兰氏阳性菌丝状菌和革兰氏阳性菌超声破碎法超声破碎法液体剪切作用液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈

8、，对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作不适合大规模操作非非机机械械法法生物法生物法酶分解作用酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离；具有高度专一性，条件温和，浆液易分离；溶酶价格高，通用性差溶酶价格高，通用性差化学渗透法化学渗透法改变细胞膜的渗透性改变细胞膜的渗透性具一定选择性，浆液易分离；具一定选择性，浆液易分离；但释放率较但释放率较低，通用性差低，通用性差渗透压法渗透压法渗透压剧烈改变渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用破碎率较低，常与其他方法结合使用冻结融化法冻结融化法反复冻结反复冻结- -融化融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物破碎率较低，不适合对

9、冷冻敏感目的产物干燥法干燥法改变细胞膜渗透性改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活条件变化剧烈，易引起大分子物质失活3.2 3.2 常用的细胞常用的细胞(xbo)(xbo)破碎破碎技术技术第14页/共50页第十五页，共50页。16机械机械(jxi)破碎破碎捣碎(do su)法研磨法匀浆法超声法 物理物理(wl)破碎破碎温度差破碎法压力差破碎法化学破碎化学破碎有机溶剂：表面活性剂：酸碱生物法破碎生物法破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，通过机械运动产生的剪切力，使细胞破碎。使细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使织、

10、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎受到破坏，而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理细胞破碎方法及其原理第15页/共50页第十六页，共50页。17第16页/共50页第十七页，共50页。18作用机理：高压作用机理：高压(goy)(goy)液体剪液体剪切力切力1 1）高压）高压(goy)(goy)匀浆法匀浆法（High-pressure homogenizationHigh

11、-pressure homogenization）细胞悬浮液从高压细胞悬浮液从高压(goy)(goy)室针形阀喷出，室针形阀喷出，高速喷出的浆液又射到静高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动细胞在这一系列高速运动过程中经历了高速剪切、过程中经历了高速剪切、碰撞及压力骤降，造成细碰撞及压力骤降，造成细胞破碎。胞破碎。第17页/共50页第十八页，共50页。19高压高压(goy)匀浆机匀浆机第18页/共50页第十九页，共50页。20第19页/共50页第二十页，共50页。21影响高压匀浆器细胞影响高压匀浆器细胞(xb

12、o)(xbo)破碎因素破碎因素第20页/共50页第二十一页，共50页。22第21页/共50页第二十二页，共50页。23WSKWSK卧式高效卧式高效(o xio)(o xio)全能研全能研磨机磨机第22页/共50页第二十三页，共50页。24第23页/共50页第二十四页，共50页。25第24页/共50页第二十五页，共50页。26第25页/共50页第二十六页，共50页。27第26页/共50页第二十七页，共50页。28技术技术原理原理效果效果 成本成本举例举例匀浆法匀浆法( (孔型孔型) )使细胞受到液体剪使细胞受到液体剪切力而破碎切力而破碎剧烈剧烈 适中适中细胞悬浮液大规模细胞悬浮液大规模处理处理研

13、磨破碎研磨破碎法法细胞被玻璃珠或铁细胞被玻璃珠或铁珠捣碎珠捣碎剧烈剧烈 便宜便宜细胞悬浮液和植物细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理细胞的大规模处理超声波法超声波法 使细胞受到液体剪使细胞受到液体剪切力而破碎切力而破碎适中适中 昂贵昂贵细胞悬浮液小规模细胞悬浮液小规模处理处理不同机械破碎不同机械破碎(p su)(p su)方法的比较方法的比较第27页/共50页第二十八页，共50页。29干燥干燥(gnzo)(gnzo)法法其中酶溶解法和化学溶胞应用其中酶溶解法和化学溶胞应用最广最广第28页/共50页第二十九页，共50页。30常用的溶酶常用的溶酶溶菌酶、溶菌酶、-1-1，3-3-葡聚糖酶、葡聚糖酶、-

14、1-1，6-6-葡聚糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、蛋白酶、甘露糖酶、甘露糖酶、糖苷酶、糖苷酶、肽键内切酶、肽键内切酶、壳多糖酶壳多糖酶第29页/共50页第三十页，共50页。31第30页/共50页第三十一页，共50页。32第31页/共50页第三十二页，共50页。33第32页/共50页第三十三页，共50页。34某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素等，可以改变细胞壁或膜的渗透性，从而抗生素等，可以改变细胞壁或膜的渗透性，从而(cng r)使胞内物质有选择地渗透出来。使胞内物质有选择地渗透出来。2) 2) 化学化学(huxu)(huxu)渗透法（

15、渗透法（Chemical permeationChemical permeation）第33页/共50页第三十四页，共50页。35A. A. 酸、碱处理酸、碱处理(chl)(chl)法法第34页/共50页第三十五页，共50页。36细胞破碎常用的表面细胞破碎常用的表面(biomin)(biomin)活性剂：活性剂：十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS，阴离子型）；，阴离子型）；非离子型如非离子型如Triton X-100Triton X-100和吐温（和吐温（TweenTween）等）等B. B. 表面表面(biomin)(biomin)活性剂活性剂表面活性剂是都是两性的，既能和水作用也

16、能和表面活性剂是都是两性的，既能和水作用也能和脂作用；脂作用；对疏水性物质对疏水性物质(wzh)(wzh)具有很强的亲和力，能结合具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏磷脂层，使某些胞内物质并溶解磷脂，破坏磷脂层，使某些胞内物质(wzh)(wzh)释放出来。释放出来。能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的能与细胞壁上的脂蛋白结合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解。通透性增加或溶解。第35页/共50页第三十六页，共50页。37能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质被释能分解细胞壁中的磷脂，使细胞结构破坏，胞内物质被释放出来。放出来。有机溶剂可采用有机溶剂可采用(ciyng)(ciy

17、ng)丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等等 C. C. 有机溶剂有机溶剂第36页/共50页第三十七页，共50页。38u通用性差；通用性差；u时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%50%；u有些化学试剂有毒。有些化学试剂有毒。u化学试剂的加入常会给随后产物化学试剂的加入常会给随后产物(chnw)(chnw)的纯化带来的纯化带来困难，困难， 并影响最终产物并影响最终产物(chnw)(chnw)纯度纯度化学化学(huxu)(huxu)渗透法特点：渗透法特点：缺点缺点(qudin)(qudin)l对产物释放有一定的选择性对产物释放

18、有一定的选择性可使一些较小分子量的物质（多肽和小分子的酶蛋可使一些较小分子量的物质（多肽和小分子的酶蛋白）透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内白）透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；l细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。分离和进一步提取。优点优点第37页/共50页第三十八页，共50页。39第38页/共50页第三十九页，共50页。40第39页/共50页第四十页，共50页。41第40页/共50页第四十一页，共50页。42使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用(ciy

19、ng)(ciyng)丙酮丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。来。气流干燥主要适用于酵母菌，一般在气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-3025-30的气流中吹干；的气流中吹干；真空干燥多用于细菌。真空干燥多用于细菌。冷冻干燥适用于不稳定的生化物质冷冻干燥适用于不稳定的生化物质C. C. 干燥干燥(gnzo)(gnzo)法法气流干燥气流干燥真空干燥真空干燥喷雾干燥喷雾干燥冷冻干燥冷冻干燥第41页/共50页第四十二页，共50页。43第42页/共50页第四十三页，共50页。44第43页/共50页第四十四页，共

20、50页。45破碎率的测定破碎率的测定(cdng)(cdng)细胞破碎后，大量带电荷细胞破碎后，大量带电荷(dinh)(dinh)的内含物被释放到水相，使导的内含物被释放到水相，使导电率上升。电率上升。 1)1) 直接测定法直接测定法2)2) 目的目的(md)(md)产物测定法产物测定法3)3) 导电率测定法导电率测定法采用染色法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。采用染色法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。如：采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受如：采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。损害的细胞呈亮红色。将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上

21、清液中目的产物含量或将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量或活性，并与活性，并与100%100%破碎率的标准值比较，计算其破碎率。破碎率的标准值比较，计算其破碎率。第44页/共50页第四十五页，共50页。46用巴氏染色用巴氏染色(rns)(rns)液（中性红）染色液（中性红）染色(rns)(rns)第45页/共50页第四十六页，共50页。47破碎破碎(p su)(p su)技术的研究方向技术的研究方向多种破碎多种破碎(p su)(p su)方法相结合方法相结合化学法、酶法、机械法相结合。化学法、酶法、机械法相结合。酶法与高压酶法与高压(goy)(goy)匀浆、超声波震荡、渗透压法结合匀浆、超声波震荡、渗透压法结合如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压如用溶解酶预处