完整版WesternBlot免疫印迹法实验方法步骤

1、Western Blot(免疫卬迹法)实验方法步骤发布日期：2008-8-25热门指数：4360Western Blot(免疫印迹法)主耍包括以下4个廉本步9轧n样品制备n电泳分离n蛋白的般转移n免疫朵交与显色一一蛋口脸测涪液和试剂n 1X璘酸盐缓冲液(PBS)n Modified RIPA bufferTris-HCI: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40:1% :Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCI: 150 mM :EDTA: 1 mM :PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml e

2、ach :Na3VO4:1 mM ;NaF: 1 mMn 1XSDS样品缓冲液62.5 mM Tris-HCI (pH 6.8 于 25° C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v 涣酚蓝n 转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸，20%甲醇(pH 8.3)n 10X Tris 缓冲盐 UBS)准备 1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCI;用 1NHCI 调 pH 为 7.6n 脫脂奶粉或BSAn 甲醇n TBS/T缓冲液1XTBS, 0.1%Tween-20)TBS/T封闭缓

3、冲液(n1X TBS, 0.1% Tween-20 加 5% w/v 脱脂奶粉或 BSAn 抗的稀释1XTBS, 0.1% Tween-20力【I 5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note: 一股来说,BSA被推荐用于多克隆抗体脱脂奶粉用于单克隆抗体.这样可得到较高的倍噪比。抗体的稀释度参 考抗体说明书或根据实验确定.n 预染的蛋口质Marker.可用芳监测转膜的效率样品制备原始样詁可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋口.以下为定性检测目的蛋Cl时细胞样品的处理方法. 其余的样品制备方法参阅相关文献1 培养細胞或药物处理。2. 弃培养基.用1XPBS漂洗细胞2次.去尽残

4、留培养基。2 plate, 500-1000 ul/M)100 ul/w 或 75 cm.刮落细胞.转样品缓冲液 3加入 1X SDS(6well plate,移到Ep管。注意：冰上操作，4. 超声10-15秒阿切DNA以诚低样品粘性。5点沸样品5 minutes6.离心12000g,5min.取上淸。7电泳分离：上样 15uk20 ul 至 SDS-PAGE 胶(10cm x 10cm)电泳.72 flask）裂cells/100 mm dish/150 cm如耍定虽检测某蛋口的表达水平应用RIPA裂解液（1 ml per 10解细胞收集裂解液至离心管中.在振荡器上泯匀4伽in. 14000

5、g离心伽in （46 弃沉淀，用Bradford法或 其它蛋白质测定方法测定上清中蛋 以调整上禅体积和I样此进行Western杂交时还需、 ；照，通常用 beta-actin,注意：一般上样20-30 ug己足够.如待检蛋门为低丰度蛋G可加大上样虽至100 ug.但电泳条带易拖电可制备 亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。电泳分离（翁照SDS-PAGE电泳方法转膜朵交膜的选择是决定Western blot M的垂耍坏节：应根据杂交方案.彼转移蛋口的待性以及分子大小等因索.选择介 适材质.孔径和规格的朵交膜用于Western blot的膜主要有两种:硝酸纤维素膜（NC）和PVDF膜。NC膜是蛋白印

6、 迹实验的标准固相支持物.在低离子转移缓冲液的环境下.大弱数带负电荷的蛋口质会与膜发生疏水作用而高亲和力的 结合在一起.但在非离子型的去污剂作用下.结合的蛋门还可以被洗脱下來。根据被转移的蛋门分子址大小.选择不冋孔径的NC朕。因为随若膜孔径的不断蔽小膜对低分子址蛋口的 结合就越牢固通常用0.45mm和0,2um两种规格的NC贩 大于20kD的蛋白可用0.45 p m的膜.小T20kD的蛋 白就骐用0.2um的膜了.如用0.45um的膜就会发生"Blowthrough"的现紀PVDF膜灵敏度.分辨率和蛋口亲和 力比常规的膜耍臥 非常适合于低分子址蛋口的检测，但PVDF膜在使用

7、Z前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。蛋口质常用的转移方法主耍有葫种：憎式漫转和半干转移。前者操作容易.转移效率高：而后者适用T大胶的蛋口转移. 所用缓冲液少。以下为槽式湿转的操作步骤1. 将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。注意：如检测小分子蛋口.可省賂此步.因小分子蛋口容易扩故出胶：2. 依据胶的大小眄取膜和沌纸6片放入转，10minll|j PVDF膜需用纯甲豚浸泡饱和35秒钟。3. 装配转移溯治：海绵？3层滤纸?胶？膜?3层濾纸?海绵每从放好后用试管赶去气泡。切记：胶放于负极面 （黑色面）.4. 将转移IfijK r冰浴中放入三明治（黑色面对黑色面人加转移缓冲液插上电极.100V. 1h

8、（电流约为0.3A）。 注总：应再次检査三明治和电极是否装配正确电源是否接通°5. 转膜结束后.切断电源，取出朵交膜spongeWhatmanfilter81*haUraspongewhitE COblaGk （）免疫朵交与昭色1用25 ml TBS洗膜5min,室蟲摇动。2. 置膜于25 ml封闭缓冲液中1h,室温.揺动。3. 15mlTBS/T 洗 3 次 <5min/T）o4加入合适稀释度的一抗.室温娜育12h或4 C过夜.缓慢揺动&5. 15 ml TBS/T 洗3次（5min/T）。6. 加入合适稀释度的Itt性磷酸的（AP）或规很过氣化阳（HRP）标记的二抗

9、.室温孵育1h缓慢摇动。）< mirVT5 次（3洗TBS/Tml 15 . 7.8. 15 ml TBS 洗 1 次。9. 蛋白检测（显色法或发光法.按相賊试剂说明操作）。注意事项：1. 操作中戴手套,不要用手融膜。2. PVDF膜在甲醇中浸泡时间不耍超过5杪。3. 如脸测小F 20kD的蛋口应用0.2 u m的膜.并可省略转移时的平衡步骤。4. 某些抗廉和抗体町被Tween-20洗脱.此时可用1.0% BSA代替Tween20°5. 关于封闭剂的选择：5%脱脂奶/TBSorPBS:能和某些抗原相互作用.掩滥抗体结合能力：0.3-3%BSAin PBS：低的内源性交叉反应性。6. 如用0.1%