完整版大肠杆菌感受态细胞的制备

1、大肠杆菌感受态细胞的希I备标签： ,CO. 分类：細胞技术 > 感受态细胞来源：实验管理实验概耍人肠杆菌感受态细胞的CaC12法制备及质粒转化实验原理处于对数生长期的细菌经CaCh处理后接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外 源DNA的状态叫感受态。在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人匸构建的质粒载体中， 般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从个细胞到力个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生种短暂的感受态,以摄取外源DNA, 转ft （Transformation）是将外源DNA分/引入爱体细胞，使之获紂新

2、的遗传性状的种手段， 它是微生物遗传、分/遗传、基因匸程等研究领域的基木实验技术。转化过程所用的受体细胞 般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不儈限制性内切晦和甲基化晦的突变体它可以 容忍外源DNA分了进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过些特殊方法（如电击法， CaC12 , RbCl（KCl）等化学试剂法）的处理后，纽I胞膜的通透性发生J'何时性的改变，成为能允 许外源DNA分J'进入的感受态细胞（Compenent cells）。进入受体细胞的DNA分通过复制、 农达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中 培养，即可筛选出转化f （

3、Transformant,即带有异源DNA分了的受体细胞）。目前常用的感 受态细胞制备方法有CaC12和RbCl（KCl）法，RbCl（KCl）法制統勺感受态细胞转化效率较高，但 CaC12法简便易行，且其转化效率完全可以满足般实验的耍求，制备出的感受态细胞暫时不用 时，可加入占总体积15%的无菌甘油于7。°C保存（半年），因此CaC12法使用更广泛。主要试剂（1）o.imol/LCaC12 溶液液体培养基（2）LB.（3）30%甘汕：3omL甘油溶于ioomL蒸馆水，高压灭菌。主要设备超净匸作台（2）冷冻离心机（3）恒温摇床一 7。°C冰箱（5）iomL移液管（6）吸耳球

4、（7）imL、200 uL移液枪（配套枪头）（8）5OmL离心管（9）i.5mL离心管实验材料人肠杆菌 DH5« <R-. M-, Amp-）实验步骤（一）受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5 a单菌落，接种于35】nL LB液体培养基中，37匸下 振荡培养过夜（12h左右）。（2）将该菌种悬液以i:ioo的比例接种，取250 uL菌液转接到25mL LB液体培养基中，37匕振 荡培养23h至OD6oo = o.5左右。（二）感受态细胞的制备（注恿：以下操作在超净匸作台完成。）将菌液转入50mL离心管中，冰上放置loniin.（2）在4°C下，4

5、ooor/min离心iOmin.弃去上淸，将管倒置imin以便培养液流尽。（3）用冰上预冷的o.imol/L的CaC12溶液lOmL轻轻悬浮細胞，冰上放置3Omin。（4）04°C 4ooor/min离心lomin.弃去上沪i，加入2mL侦冷的o.imol/L的CaC12溶液，轻 轻悬浮细胞，冰上放置（务必冰上放置）。（注盘：以上操作完成/新鲜感受态细胞的制备）（三）感受态细胞的分装与冻存在2mL制备好的感受态细胞中加入2mL3o%甘油（即1：1体积,甘油终浓度巧）。（2）将此感受态细胞分装成每份2OOuL（i.5mLdorf管），液氮速冻，快速转入-7。匸冰箱保"C冰 箱

6、保存o） -70存。（如果没有液氮，可以将分装的感受态细胞宣接转入.注盘事项、细胞的生长状态和密度最好从-7。°C或-2O°C甘汕保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过幺 次转接，及贮存在4'C的培养菌液。细胞生长密度以每奄升培养液中的细胞数在5X107个左右 为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD6oo控制。对TG1菌株, OD6oo为o. 5时，细胞密度在5X107个/ml左右。（应注运OD6oo值与细胞数之间的关系随 菌株的不同而不同）。密度过高或不足均会使转化率下降。此外，受体细胞般应是限制-修饰 系统缺陷的突变株

7、，即不含限制性内切酗和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的我 体性质相匹配。、试剂的质量所用的CaC12等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4°C。、防ll:杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的,并经高用 灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注总:防il:彼其它试剂、DNA幽或杂DNA所污染，否则均 会影响转化效率或杂DNA的转入。、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。人人都爱protocol。蛋白的纯化1. 菌液离心取出三角瓶,倒入离心管中，离心（6000rpm,10min

8、,4°C）.离心之后倒去上淸.2. 细胞重悬加上2mL的lysis buffer洗沉淀，重悬细胞.lysis buffer 配方是 HEPES (2M,PH 7.0)200pl, Nacl (4M) 500pl, DTT 3pl, Brij 100pl,PMSF 200pl,H20 19ml,共 20ml 体系.3. 初步溶解加入溶菌酶20jjI (100mg/ml)于重悬液中 撚后冰浴20min.再用1.5ml EP管分装.冷冻4.将分装后的菌体放入-80C冰箱里冷冻约20min (或者使用液氮快速冷冻细胞悬液后，取曲待其融化。5. 细胞破碎融化之后破碎细胞，用超声波细胞粉碎机破碎

9、每次10s, interval 20s, 20次.若量人可用压榨机来 破碎.6. 离心离心细胞破碎液,12500rpm/lh,4:C撚后收集上清并转另个1.5ml管再加100pl IM Tris-HCI buffer(PH 8.0)到上淸中。(碱性有利于蛋口的获得可以先放-80.7. 纯化上淸(1)准备Ni柱在试管中加上空柱，缓慢滴加300pl的Ni柱于空柱中,待其完全沉淀(每300pl树脂液中有5%Ni-NTAagnose)o 再用 2ml 的 AT buffer 平衡柱 了 (人约 lh )e AT buffer 配；/： Tris-HCl IM PH8.0 1000pl,NaCl 4M

10、1000pl,Brij 20pl,DTT 3pl, H2O 18ml.上样加2ml上淸到Ni柱中，并用2ml AT buffer冲洗.(注意缓慢滴加)洗脱样品加上 lml 的 salt washing buffer 冲洗，其配方是 AT buffer 8ml,NaCl 5M 2ml,Brij lOOpl.再加上 1ml 的 Imidazole buffer(AT buffer 9.8ml Jmidazole IM 0.2ml)冲洗'洗去非特异性蛋白。再洗脱目的蛋白用300pl的Elution buffer冲洗，获得所需的特异性蛋白.Elution buffer配方:AT buffer

11、7.5ml,Imidazole IM 2.5ml.8. 纯化细胞破碎液的沉淀用urea buffer重悬细胞沉淀，在常温温育lh,再离心(12500rpm lh 4°C),收集上淸,重复上HCI IM PH8.0 1000$,NaCl 4M lOOOpI, Brij 20pl,Tris-的配方是.urea buffer淸纯化步骤.DTT 3pl, urea 8M 18ml.其余 buffer 均用 urea buffer 来配置.9.SDS-PAGE 的鉴定配胶(根据此蛋白的人小(55KD)，配置12%的胶)下层胶的配方:Acr/Bis4.44ml,下层胶缓冲液PH8.83.75ml

12、,TEMED7|ul,10%APS75pl,ddH2O6.8ml.上层胶的配方是：Acr/Bis0.75ml,±层胶缓冲液1.5mlJEMEDPH6.84Ml,10%APS37.5pl/ddH2O3.75ml.配置样品 loading buffer 混合好 20pl 体系.每管加样 品2Ml,5xloading buffer 4pl,再加ddH2O补全°C下直约5min撚后置室温下冷却后上样JOO 和样品后，在：纯化上淸；样品2：纯化沉淀：样品1 ：未纯化沉淀；对照3：标准甘油激酶对 照1：未纯化上淸；对照2上样同时加上Marker,10$.添加样品，上样20山，电泳调好电

13、 压进行“-定要浸没过板，形成电流通路(lx),加上足够的电泳缓冲液要加在两板内外.便可停 il.Joading buffer条带跑到底，电泳，约lh后(5)考马斯亮蓝染色”加热至沸腾后停止加入50ml 弃去水溶液继续在脱色摇床上摇动5min,停止加热后继续在脱色摇床加热沸腾后保持状态30-60S,加上染色液，以浸没胶面为准.弃去染色液lOmin,上摇动停止加热后在摇床上要30-60s,50ml加入约的水再加热至沸腾后 保持沸腾状态.换水可完成脱色5-lOmin,.若要得到无背景的染色胶可重复脱色步骤或将胶放在水中过夜.線柱。用不同浓度的咪堆洗脱。因为咪哇和组氨酸都带正电，可在咪卩坐逐渐加人浓

14、度的条件下洗脱目的蛋白。protocol里有啊。分离蛋白质混合物的各种方法主要是根据蛋白质在溶液中的以下性质：1）分/人小；2溶解度： 3）电荷；4）吸附性质：5）对其它分/的生物学亲和力等进行分离.常见的分离提纯蛋.1、盐析与有机溶剂沉淀：在蛋白质溶液中加入人量中性盐，以破坏黃口质的胶体性质，使黃白质从溶液中沉淀析出，称为盐析.常用的中性盐有：硫酸钱、氯化 钠、硫酸钠等.盐析时,溶液的pH在蛊口质的等电点处效果最好.凡能与水以任总比例混合的有机 溶剂，如乙醇、甲醇、丙酣等，均可引起養白质沉淀.2、电泳法：蛋低于其pl的溶液中带净的负或正电荷，内此在电场中可以移动.电泳迁移率的人小主要取决于蛋

15、白质分J'所带 电荷量以r人小.3、透析法：利川透析，町将人分产物质与小分于物质分肉开.4、层析法：利用混介物中各组分理化性质的差在相互接触的两相（固定相与流动相）之间 的分布不同而进行分离.主要仃离了交换层析，凝胶层析，吸附层析及於和层析等，其中凝胶层析可 用于测定蛋E 勺分/量.5、分子筛：又称凝胶过滤法，蛋i桥液加于柱之顶部，任其往卜渗漏, 小分j蛋口质进入孔内,因而在柱中滞留时间较长，人分r蛋白质不能进入孔内而径自流出”1此 不同人小的蛋口质得以分离.6、超速离心：利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液 层而分离.超速离心也可用来测定蛋口质的分/量，蛋门质的分r量与其

16、沉降系数S成正比.蛋口纯化过程中，过完柱子后的上淸称为什么？我们称为流穿液.蛋口过操柱纯化的原理和步骤是什么?Ni柱中的氯化線可以与有His （组蛋白）标签的蛋白结合，也可以与咪"坐结合.步骤是：过柱（前可以选择Ni柱重生，也就是往柱/里倒氯化線，个柱长体积就行了，然后平衡 柱&拿你自己的buffer,给蛋白捉供最适的环境，我般平衡4个柱长，然后蛋白上样,你可以让他自 己挂，这样挂柱了的效果好-些,如果流速太慢，可以加个恒流泵，但是定不能太快，太快挂柱效果 差，当然你也可以选择循环挂柱,就是恒流泵的-头接你装蛋白的烧杯，从柱了中留下来的液体还 用同个烧杯接回去.挂完之后，按理

17、想来讲，你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了，杂蛋白多数在烧杯 里，留下来了，当然肯定有少量杂蛋白也挂上r,这时候你要梯度洗脱，拿味哇和你的buffer配，般 从020mM 40mM.100mM这样洗脱（当你不知道你的蛋白人槪在什么时候出来的时候）我指的 是咪I坐的终浓度.咪哇加入之后，会和蛋白争夺与Ni的结合位点，杂蛋白、你的目的蛋白，会在不同 的浓度彼洗脱下来，洗完之后，你可以用200mM咪哇洗柱清理切蛋白，然后平衡几次,是否选 择重生你自己定咯然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯检测在哪个管f里SDS-page然后,过的蛋白用不同的管f收下2016.4.4周1：小摇：9点半，每个菌种5ml双抗培养基（5ml新离心管），分别1,2, 4号菌种。 共2种菌（100:1接菌）（1000:1加入抗生素）加入100微升保存的菌种液。250rpm, 3-4h试试。下午一点开始大摇。大摇：一个1L的锥形瓶中5ml菌液+300ml双抗培养基，250rpm, 2-3h, 4点半。 当0D600约为0. 6左右时（分光光