实验九细胞骨架观察

1、实验九 细胞骨架观察( 4 学时)一、实验目的掌握植物细胞骨架的结构特征及其制备技术。二、实验原理细胞骨架( cytoskeleton )是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成成分和形态结构的不同可分为微管(MT , 20- 25nm)、微丝(MF , 5 7nm)和中间纤维(IF, 8 11nm)。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。光学显 微镜下细胞骨架的观察多用 1% Triton X-100 处理细胞，可使细胞膜和细胞质中的蛋白质和 全部脂质被溶解抽提掉， 而细胞骨架系统的蛋白质不受破坏被保存， 经戊二醛固定， 考马斯 亮兰 R250 染色后，

2、微管不够稳定，其他类型纤维太细，无法分辨，只能观察到由微丝组成 的微丝束(40nm)为网状结构。三、实验仪器、材料和试剂(一) 仪器、用具： 光学显微镜，镊子，剪刀，试管，表面皿，滴管，载玻片，盖玻片， 染色缸，烧杯。(二) 材料：新鲜洋葱鳞茎(三) 试剂1) M 缓冲液( pH 7.2)：50mmol/L 咪唑(MW:68.08，3.4g/L)(缓冲剂)50mmol/L KCl(MW:74.55, 3.73g/L)0.5mmol/L MgCl 2 6H20(MW:203.30, 0.1g/L)或 MgCI 2(MW:95.3, 0.05g/L)1mmoI/L EGTA(MW:380.36,

3、0.38g/L) (和 EDTA 敖合 Ca2+,并在 Mg"存在时，骨架纤维保持聚合状态并较为舒张)0.1mmol/L EDTA (MW:292.25, 0.29g/L)或 EDTA Na2 ( MW:372.24,0.37g/L )1mmol/L DTT(MW:154.3, 0.15g/L)用 1M HCl 调至 pH7.22) 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液( PBS)(pH7.3)：PB50mlNaCl0.15M蒸馏水 至 1L100ml 0.2 M 磷酸缓冲液( PB)( pH7.3)：0.2 M Na 2HP0477ml 0.2 M NaH 2P0423ml0.2 M

4、Na 2HPO4： Na2HPO4 2H2O (MW : 178.05, 3.561 g/100mL)或 Na2HPO4 12H2O MW： 358.22， 7.164 g/100mL)0.2 M NaH2PO4： NaH2PO4 H2O ( MW : 138.01, 2.76 g/100mL )或 NaH2PO4 2H2O MW： 156.03， 3.12 g/100mL)3) 1% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)溶于M-缓冲液4) 3% 戊二醛 100mL: 取 50% 戊二醛 6mL ,PBS 94mL考马斯亮蓝甲醇冰乙酸 蒸馏水R2500.2g( 0.04g/20mL )5) 0.2% 考马斯亮蓝 R250 染液：46.5mL( 9.3ml/20mL )7mL (1.4ml/20mL )46.5 mL( 9.3ml/20mL )四、实验方法与步骤烧杯中，使其下沉。(2) 吸去磷酸盐缓冲液，用1% Trit on I00处理20 30min。(3) 吸去Trit on I00，用M缓冲液洗3次，每次10min。(4) 3%戊二醛固定 0.5 1h。(5) pH7.3磷酸盐缓冲液洗 2次，每次10min。(6) 0.2%考马