1805微生物操作SOP(第一版)1

1、1805组微生物、化学实验方法学手册1805 组微生物、化学实验方法学（第一版）编制人（按拼音排序）：曹海龙；黄李淑馨；刘航；刘启顺 王晓辉；杨凤丽；岳敏；赵勇编制日期：2011年11月15日i1805组微生物、化学实验方法学手册目录第一章、无菌操作技术 41.1 常用灭菌方法概述 41.1.1、 力口热法41.1.2、 滤除菌51.1.3、 辐射杀菌61.1.4、 化学药物的消毒与灭菌 61.2 灭菌方法71.2.1、 干热空气灭菌71.2.2、 高压蒸汽灭菌81.2.3、 紫外线及化学试剂灭菌 121.2.4、 微孔滤膜过滤除菌 131.2.5、 化学消毒剂的杀菌作用 141.3 无菌操作

2、和微生物接种技术 17第二章、菌种的保藏 242.1 菌种保存方法概述 242.2 实验室常用菌种保存方法 241 .2.1定期移植保藏法242 . 2.2 -80 c低温冷冻保藏 252.3 复苏方法25第三章、感受态菌株的制备及 dna转化方法 263.1 大肠杆菌感受态菌株的制备及 dna转化方法（黄李淑馨） 263.1.1 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法） 263.1.2 大肠杆菌感受态细胞的转化 263.2 短乳杆菌感受态菌株的制备及 dna转化方法（岳敏） 263.2.1 短乳杆菌感受态细胞的制备 263.2.2 短乳杆菌感受态细胞的转化（电转化方法）273.3 酿酒酵母感受态

3、菌株的制备及 dna转化方法（曹海龙） 273.3.1 短乳杆菌感受态细胞的制备（醋酸锂法） 273.3.2 酿酒酵母感受态细胞的转化（醋酸锂法） 283.4 毕赤酵母感受态菌株的制备及 dna转化方法（刘航） 283.4.1 实验前的准备 283.4.2 限制性酶切283.4.3 毕赤酵母感受态细胞的制备 283.4.4 电转化 29第四章基因的克隆与测序（黄李） 304.1 基因克隆的常规方法 304.2 基因组文库基因克隆方法（黄李） 304.3 race法基因克隆（张建平） 30第五章 酶的表达方法 315.1 大肠杆菌系统表达方法（黄李） 315.2 毕赤酵母系统表达方法（刘航） 3

4、15.2.1 毕赤酵母组成型基因表达方法 315.2.2 毕赤酵母诱导型基因表达方法 31第六章酶活的测定方法326.1 多糖降解酶酶活测定方法 326.1.1 壳聚糖酶酶活的测定方法（张建平） 326.1.2 几丁质酶酶活的测定方法（赵勇） 326.1.3 褐藻胶裂解酶酶活的测定方法（黄李） 326.1.4 菊粉酶酶活测定对方法（曹海龙） 336.2 代谢过程酶酶活测定方法 356.2.1 丙酮酸竣化酶酶活测定方法（曹海龙） 356.2.2 异柠檬酸裂解酶酶活测定方法（曹海龙） 37第七章酿酒酵母基因敲除方法（曹海龙） 39第八章酶的分离0屯化方法42第九章化学实验注意事项和方法学（刘启顺、

5、杨凤丽） 4210第一章、无菌操作技术（王晓辉）1.1 常用灭菌方法概述微生物在自然界中分布广泛，为了保证生产和科学研究所需菌株不受其它杂菌干扰，灭菌和消毒技术至关重要。灭菌和消毒两者概念不同，灭菌是指杀死或消灭环境中所有微生物（包括芽抱和抱子）；消毒是指消灭病原菌和有害微生物营养体。但对于同一种方法来说，不同作用强度和时间可达到灭菌或消毒不同目的。灭菌和消毒方法有多种，分为物理法和化学法两大类。物理法包括加热灭菌（干热灭菌 和湿热灭菌）、过滤除菌、紫外线灭菌等。化学法是利用无机或有机化学药剂进行消毒与杀 菌。人们可根据微生物特点、待灭菌材料、实验目的和要求选用不同灭菌和消毒方法。1 .1.1

6、、加热法加热灭菌主要利用高温使菌体蛋白质变性或凝固、酶失活而达到杀菌目的。 根据加热方式不同，分为干热灭菌和湿热灭菌。（一）干热灭菌干热灭菌包括火焰烧灼灭菌和热空气灭菌。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针、接种钩等。无菌操作时试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。对于小刀、镣子、载玻片、玻 璃涂棒可预先浸泡在 75%酉精中，使用时取出，瞬间通过火焰灼烧灭菌。应该注意的是，接种完毕，接种针灼烧先从中部开始（使热度由针的中部传递到端部， 使微生物逐渐焦化），再将针端移到火焰上直立灼烧；也可将接种针置于外焰过渡处理后再 彻底灼烧，避免直接灼烧微生物引起爆散，污染环境。热空气灭菌是利用加热的高温 （16

7、0c180c）空气进行灭菌的方法。 此法适用于耐高 温玻璃制品、金属制品及保藏微生物用的沙土、 石蜡油以及碳酸钙等物品的灭菌， 同时对新 制作的试管及三角瓶棉塞具有固定形状作用。（二）湿热灭菌湿热灭菌主要通过加热煮沸或热蒸汽杀死微生物。常有高压蒸汽灭菌、常压间歇灭菌、 煮沸灭菌和超高温杀菌等方法。2 .高压蒸汽灭菌将物品放在密闭高压蒸汽灭菌锅内0.1 mpa、121c灭菌2030 min。时间长短可根据灭菌物品种类和数量不同有所变化，以达到彻底灭菌为准。此法适用于培养基、工作服、橡胶制品、玻璃器皿等灭菌。3 .常压间歇灭菌常压间歇灭菌是利用水蒸汽把培养基加热到100c,分几次蒸煮，达到彻底灭菌

8、又保护培养基营养成分的目的。 它是通过间歇灭菌器 （阿诺氏灭菌器）达到灭菌目的。阿诺氏灭菌 器类似铝质或铁质蒸笼， 灭菌时，通过加热使温度达100c,常压下使水一直保持沸腾状态， 利用不断产生水蒸汽来灭菌。间歇灭菌分三次进行，第一次100c灭菌30 min,其中营养体被杀死，培养物取出于培养箱培养一定时间（芽抱发育成营养体）；第二次100c灭菌30 min,发育营养体又被杀死，但仍可能留有芽抱，再重复一次，彻底灭菌。此法适用于不能用高压蒸汽灭菌培养基，如明胶培养基、牛乳培养基、 含糖培养基等。缺点是灭菌较麻烦，工作周期长。4 .煮沸灭菌将水煮沸保持1015 min ,可杀死繁殖体；13 h可杀

9、灭芽抱。如在水中加入 1呛2% 碳酸氢钠或 工心5%5炭酸，能增强杀菌作用，效果更好。在高原地区，因气压低导致沸点 低，需要延长煮沸时间，海拔每增高300 m,延长2 min。将刷洗干净物品全部浸入水中，大小相同器皿不能重叠， 确保物品各面与水接触。 锐利、细小、易损物品用纱布包裹，以免撞击或散落。玻璃、搪瓷类制品放入冷水或温水中煮沸， 金属、橡胶类制品待水沸后放入。消毒时间以水沸后开始计算，消毒后及时取出，其“无菌”有效期不超过6 h。此法适用于耐高温搪瓷、金属、玻璃和橡胶类制品等。如注射器和解剖器械等，但注射 器和解剖器械也可采用高压蒸汽灭菌或干热灭菌，或采用一次性无菌用品。5 .超高温杀

10、菌指温度和时间分别为 135150c和28 s条件下对牛乳或其它液态食品（果汁、果汁 饮料、豆乳、茶、酒、矿泉水等）进行处理的一种工艺。其特点是既能杀死产品中微生物， 又能较好保持食品品质与营养价值。超高温杀菌工艺应用， 使乳制品及各种饮料等无需冷藏的理想变成现实，打破地域和季节限制。6 .1.2过滤除菌微生物虽小，但有一定体积，通过过滤除菌也能把它们除掉。过滤除菌是把含菌液体或气体中微生物通过滤器（由各种多孔径介质构成滤板）截留在滤板上，从而达到滤菌目的。滤器有多种类型，根据滤板介质不同，滤器有硅藻土滤器、石棉板滤器、玻璃滤器、陶瓷滤器、火棉胶滤器、滤膜滤菌器；根据过滤对象和滤板介质，滤菌器

11、有液体滤菌器和空气滤菌器两类。空气过滤器常用介质是棉花纤维和玻璃纤维。前者如实验室试管棉塞、棉滤管过滤器和发酵工厂车间中总过滤器。后者如超净工作台、接种室和发酵工厂常用一种空气滤菌器过滤介质。应用广泛过滤器有蔡氏过滤器和微孔滤膜过滤器。蔡氏过滤器是由石棉制成圆形滤板和一个特制金属漏斗组成，分上下两节，过滤时，用螺旋把石棉板紧紧夹在上、下两节滤器之间，然后将溶液置于滤器中抽滤，每次过滤必须用一张新滤板。据孔径大小滤板分为三种型号：k型最大，作一般澄清用；ek型滤孔较小，用来除去一般细菌；ek- s型滤孔最小可除去大病毒。微孔滤膜过滤器是一种新型滤器，其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤维酯混合物制成薄膜

12、，孔径为0.02510.00 um）过滤时，液体和小分子物质通过，细菌被截留在滤膜上。实 验室中用于除菌微孔滤膜孔径一般为0.20 umi微孔滤膜不仅用于除菌，还可用来测定液体或气体中微生物，如水中微生物检查。过滤除菌适用于以下几个方面：对热不稳定、体积小的液体材料（如血清、酶、毒素、 噬菌体等）；高温灭菌易遭破坏各种培养基成分（如尿素、碳酸氢钠、维生素、抗生素、氨 基酸等）；空气中细菌等微生物（如安装在超净工作台、发酵罐空气进口、微生物无菌培养 室、细胞培养室、精密仪器仪表厂、医药和食品等部门、科研单位各种空气过滤装置）。7 .1.3、辐射杀菌辐射分为紫外线等非电离辐射和丫射线等电离辐射。紫

13、外线波长在200300 nm,具有杀菌作用，其中以 256266 nm杀菌力最强。在波长 一定条件下，紫外线杀菌效率与强度和时间乘积成正比。紫外线杀菌机制主要是因为紫外线诱导dna胸腺喀咤间形成胸腺喀咤二聚体，从而抑制dna正常复制（但不能在开着日光灯或鸨丝灯情况下开启紫外灯进行杀菌，因可见光能 激活微生物体内光复活酶，使形成胸腺喀咤二聚体拆开复原）。另外，空气在紫外线辐射下产生臭氧（。3）；水在紫外线辐射下被氧化生成过氧化氢（h 2。2）。h 2o2和。3均有杀菌作用。紫外线穿透力极差，适用于接种室、超净工作台、无菌培养室及手术室空气、物体表面 灭菌。紫外线灭菌是通过紫外线灭菌灯进行，紫外线

14、灯距离照射物体以不超过1.2 m为宜。紫外线对人体有损伤作用，可严重灼烧眼结膜而损伤视神经，对皮肤也有刺激作用，所以不能直视开着紫外线灯，更不能在开着紫外灯下工作。此外，？射线和丫射线等因具较高能量与穿透力，在常温下可对不耐热物品杀菌。其机 理在于产生游离基，破坏 dna。广泛应用于不能进行加热灭菌的纸张、塑料薄膜、各种积 层材料制作容器及医用生物敷料皮等灭菌。？射线和丫射线灭菌最大优点：穿透力强，在厚包装完好条件下灭菌。8 .1.4、化学药物的消毒与灭菌化学药物的消毒与灭菌是指应用能抑制或杀死微生物的化学试剂进行消毒灭菌方法。它们主要是通过改变细胞膜通透；蛋白质变性或凝固；改变原生质的胶体性

15、状，使菌体发生沉淀或凝固来达到消毒与灭菌目的。根据化学药物的效应，可分为灭菌剂、消毒剂、防腐剂。灭菌剂是指能杀死一切微生物的化学药品；消毒剂是指能杀死病原菌和其它有害微生物的化学药品；防腐剂是指只能防止或抑制微生物繁殖的化学药品。三者之间界限难以明确区分，一种药物在低浓度时，可作防腐剂或消毒剂，而在高浓度时，可作杀菌剂。化学药品对微生物作用是抑菌还是杀菌以及作 用效果还与处理微生物时间长短，微生物种类及微生物所处环境等因素有关。化学消毒剂按其化学性质可分以下几类：无机酸、碱及盐类；重金属盐，如汞盐、银盐 等；氧化剂，如高镒酸钾、过氧化氢、过氧乙酸及臭氧等；卤素及其化合物，如氟、氯、漂白粉、碘等

16、；有机化合物，如酚类、醇类、甲醛、有机酸及有机盐等；表面活性剂，如新洁而灭等；矿质元素，如硫磺。按灭菌作用可分为高效消毒剂（可杀灭一切微生物），如过氧乙酸、甲醛等；中效消毒剂（可杀灭抵抗力较强结核杆菌和其它细菌、真菌和大多数病毒）如乙醇、新洁而灭等；低效消毒剂（只能杀灭除结核杆菌以外的抵抗力较弱细菌、真菌、病 毒），如高镒酸钾等。实验室中常用化学药品有 2%煤酚皂溶液（来苏尔），0.25%新洁尔灭，0.1%升汞，3%- 5%甲醛溶液，75%乙醇溶液等。常用化学杀菌剂应用范围和浓度见下表。常用化学杀菌剂应用范围和常用浓度表类别实例常用浓度应用范例醇类乙醇70% 75%皮肤及器械酸类乳酸0.33

17、1 mol/l空气（喷雾或熏烝）食醋35 ml/m3熏蒸空气，预防流感碱类石灰水1% 3%地面酚类石炭酸5%空气（喷雾）石、尔福尔马林2% 5%空气、皮肤醛类10%溶液 26 ml/m3接种室、箱或厂房熏烝重金属离子升汞0.1%植物组织（如根瘤）表向硝酸银0.1% 1%皮肤氧化剂高镒酸钾0.1% 3%皮肤、水果、茶杯过氧化氢3%清洗伤口氯气0.2 1 ul/l饮用水清洁漂白粉1% 5%洗刷培养基、饮水及粪便染料结晶紫2% 4%外用紫药水，浅创伤口去污剂新洁尔火水稀释20倍皮肤、不能遇热皿1.2 灭菌方法1.2.1 干热空气灭菌一、目的1 . 了解干热灭菌原理和应用范围。2 .掌握干热灭菌操作技

18、术。二、原理干热灭菌是利用高温使微生物细胞内蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。细胞内蛋白质凝固变性与其含水量有关，环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快；反之含水量越小， 凝固越慢。干热灭菌温度为160180c,时间为12 ho干热灭菌温度不能超过 180c,否 则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。干热烘箱是干热灭菌常用仪器，它是通过电热丝进行加热和调温，不仅用来灭菌，也可用于器皿等材料烘干。干热灭菌适用范围：玻璃器皿（培养皿、锥形瓶、试管、离心管、刻度吸管等），金属用具（牛津杯、镣子、手术刀等）和其它耐高温物品（陶瓷培养皿盖、沙土管、石蜡油、碳 酸钙等灭菌）。三、材料、仪器培养皿、试管

19、、报纸或牛皮纸、吸管、干热烘箱。四、方法1 .装入待灭菌物品将包好待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入箱内，一般不超过总容量2/3,关好箱门。注意：玻璃器皿在灭菌前应洗净、晾干；灭菌物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通； 灭菌物品不能用油纸包扎，不要紧靠四壁，以防包装纸烧焦起火。2 .升温关闭烘箱门，打开通气孔（排除箱内冷空气和水汽）；接通电源加热，箱内温度升到100c150c时，关闭通气孔，继续加热。3 .恒温当箱内温度升到要求温度（16卜170c）时，调节恒温调节器，恒温维持一定时间（12 h）。注意：干热灭菌过程中，严防恒温调节器控制失灵造成事故。4 .降温关闭电源，自动降温。5 .开箱

20、取物待温度降到70c以下，方可打开箱门，取出灭菌物品。注意：箱内温度未降到 70c以前，切忌打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。五、问题1 .在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题？为什么？2 .为何干热灭菌比湿热灭菌所需温度高、时间长？1.2.2高压蒸汽灭菌一、目的1 . 了解高压蒸汽灭菌原理。2 .掌握高压蒸汽灭菌操作技术。、原理高压蒸汽灭菌是将待灭菌物品放在一个密闭加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间水沸腾而产生蒸汽。 待水蒸汽将锅内冷空气驱尽后，关闭排气阀，继续加热，此时由于水蒸汽不能溢出，增加灭菌锅内压力，使水沸点升高，得到比100c高蒸汽温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌目的

21、。当锅内压力为0.1 mpa,温度121c时，一般维持2030 min,即可杀死一切微生物营养体、抱子及芽抱。同一温度下，湿热杀菌比干热杀菌强。其原因有三：湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度低；湿热穿透力比干热强；湿热蒸汽有潜热存在。1g水在100c时，由气态变成液态时可放出2.26 kj热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体温度，从而增加灭菌效力。高压蒸汽灭菌器是一个耐压、密闭的金属锅，有立式（图6）、卧式（图6）、手提式（图7）三种。实验室以立式、手提式为主，卧式用于大批量物品灭菌及消毒。不同类型灭菌器 虽大小外形各异，但基本结构大致相同：外锅装水，供发

22、生蒸汽用，与之连通有水位玻管以标志水量。外锅一般均有石棉或玻璃棉的绝热层防止散热。内锅（灭菌室）是放置灭菌物的 空间，可配制铁架以分放灭菌物品。灭菌器上装有表示锅内温度和压力的温度计、压力表。温度计可分为两种：一种是直接插入式水银温度计装在密闭的钢管内，焊接在内锅。另一种感应式仪表温度计， 其感应部分安装在内锅排气管，仪表安装在锅外底部，便于观察。压力表内外锅各装一只，大多数压力表标明四种单位：公制压力单位（kg/cm2）、英制压力单位（磅/英寸2）、压力法定计量单位（pa）和温度单位（c）,便于灭菌时参考。灭菌锅还有排气口、安全阀。排气阀内外锅各一个，用于排除空气。新型灭菌器多在排气阀外装有

23、气水分离器（疏水管），内有由膨胀盒控制活塞，利用空气、冷凝水与蒸汽之间温度控制开关， 在灭菌过程中，可不断自动排出冷空气。 安全阀利用可调弹簧控制活塞，超过额定压力即自动放气减压。如果压力超过一定限度，安全阀门便自动打开，放出过多的蒸汽。图6立式、卧式火菌锅立式灭菌锅1.压力表2.保险阀3 .锅盖4.排汽口5.橡皮垫圈6.烟通道 7.装料桶 8.保护壳9.蒸汽锅壁10.排水口 11.底脚1805组微生物、化学实验方法学手册卧式灭菌锅1.压力表2.蒸汽排气阀3.门4.温度计阀5.蒸汽供应阀6.蒸汽进口7排气口 8.夹层 9.室 10.通风口高压蒸汽灭菌技术关键是在压力上升之前需将锅内冷空气排尽。

24、若锅内未排尽冷空气， 压力表虽指0.1 mpa、但锅内温度实际只有 100c,结果造成灭菌不彻底。下表是灭菌锅内 有不同分量空气时，压力与温度的关系。灭菌锅内有不同分量空气时，压力与温度关系表压力表读数mpa灭菌锅内的温度/c空气完全排除空气排除2/3空气排除1/2空气排除1/30.03510910094900.0701151091051000.1051211151121090.1401261211181150.1751301261241210.210135130128126高压灭菌时过高温度常对培养基造成不良影响：出现混浊、沉淀，天然培养基成分加热沉淀出大分子多肽聚合物，培养基中ca2+、m

25、g2+、fe2+或fe 3+、zn2+、cu2+等阳离子与培养基中可溶性磷酸盐共热沉淀；营养成分破坏或改变，酸度较高时淀粉、蔗糖、乳糖或 琼脂灭菌过程中易水解，ph 7.5 0.1mpa、121c灭菌20 min,葡萄糖破坏20%,麦芽糖破坏50%,若培养基中有磷酸盐共存，葡萄糖转变成酮糖类物质，培养液由淡黄变为红褐色，破 坏更为严重； ph 7.2培养基中的葡萄糖、蛋白月东、磷酸盐在0.1 mpa、121c灭菌15 min以上可产生抑制微生物生长的物质；高压蒸汽灭菌后培养基ph下降0.20.3;高压蒸汽灭菌过程会增加冷凝水，降低培养基成分浓度。对于前三种不良影响，可采用低压灭菌（如在0.05

26、6 mpa、112.6c 30 min灭菌葡萄糖溶液）；或将培养基几种成分分别灭菌，临用前无 菌混合（如磷酸盐与ca2+、mg2+、zn2+、cu2+等阳离子溶液混合）；特殊情况时可采用间歇灭菌、过滤除菌（如维生素溶液）。工业发酵生产中常采用超高温灭菌法（135140c、515 s）和连续蒸煮法。三、材料、仪器培养皿、报纸、吸管、试管、锥形瓶、培养基、高压蒸汽灭菌锅。 四、方法 1.灭菌操作（1）加水打开高压蒸汽灭菌锅锅盖，加适量水。不同高压蒸汽灭菌锅加水方法不同，具体操作见各高压蒸汽灭菌锅说明书。注意：切忌忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干引起爆炸。 101805组微生物、化学实验

27、方法学手册(2)放入待灭菌物品将待灭菌物品放入灭菌桶内。注意：灭菌物品不要放得太挤和紧靠锅壁，以免影响蒸汽流通和冷凝水顺壁流入灭菌物品。(3)加盖将灭菌锅盖上的软管插入灭菌桶槽内，有利于锅内冷空气自下而上排出(对手提式灭菌锅而言)。加盖，上下螺栓口对齐，再以对角方式均匀旋紧螺栓，使螺栓松紧一致，以免漏 气。(4)排放锅内冷空气及升温灭菌打开排气阀，加热，自锅内开始产生蒸汽35 min再关紧排气阀(或喷出气体不形成水雾)，此时已将锅内的冷空气排尽，温度随蒸汽压力增高而上升，待压力逐渐上升至 所需温度时，控制热源，维持所需压力和温度，并开始计时v8图7手提式灭菌锅2.压力表3.放气阀4.软管(一般

28、培养基 0.1 mpa、121c灭菌20 min,含糖等成分培养 基在0.056 mpa、112c灭菌15 min ,但为了保证效果， 可将 其它成分先0.1 mpa、121 c,灭菌20 min,然后以无菌操作 手续加入糖溶液)。灭菌到所需时间，停止加热，压力随之 逐渐降低。注意：灭菌主要因素是温度不是压力，锅内冷空1.安全气必须完全排尽，才能关上排气阀；灭菌时人不能离5.紧固螺栓 6.灭菌桶7.筛架8.水开工作现场，控制热源维持灭菌时压力，压力过高不仅培养基的成分被破坏，而且高压蒸汽灭菌锅超过耐压范围易发生爆炸，造成事故。(5)灭菌完毕降温及后处理待压力降至零时，慢慢打开排气阀、开盖，立即

29、取出灭菌物品。 灭菌后的培养皿、试管、 吸管等需烘干或晾干。注意：压力未完全降至零处前， 不能打开锅盖，以免培养基沸腾将棉塞冲出，也不可用冷水冲淋灭菌锅迫使温度迅速下降。灭菌物品开盖后立即取出，以免凝结在锅盖和器壁上的水滴弄湿包装纸或落到被灭菌物品上，增加染菌率。若连续使用灭菌锅， 每次灭菌前需补足水分； 灭菌完毕，除去锅内剩余水分，保持灭菌 锅干燥。2.无菌试验可抽少数灭过菌培养基置37c恒温培养箱中培养12 d。若无菌生长，即视为灭菌彻底。五、结果1 .概述高压蒸汽灭菌原理和适用范围。2 .检查培养基灭菌是否彻底。六、问题高压蒸汽灭菌关键的控制点及注意事项有哪些？1.2.3紫外线及化学试剂

30、灭菌一、目的了解紫外线灭菌原理和方法 二、原理紫外线杀菌机理主要是因为它诱导胸腺喀咤二聚体形成和dna链交联，从而抑制dna复制。另一方面，由于辐射能使空气中氧电离成o,再使。2氧化生成臭氧(。3)或使水(h2o)氧化生成过氧化氢(出。2)。3和h2o2均有杀菌作用。此外，为了加强紫外线灭菌效果， 在开紫外灯前，可在无菌室内或接种箱内喷洒3%5%石炭酸溶液，使空气中附着有微生物的尘埃降落，同时也可以杀死一部分细菌。无菌室内的桌面、凳子可用2%3%来苏尔擦洗，然后再开紫外灯照射，既增强杀菌效果，又达到灭菌目的。紫外线穿透力不强， 只适用于无菌室，接种箱，手术室内空气及物体表面的灭菌。 紫外 线灯

31、距照射物以不超过 1.2 m为宜。三、材料、仪器d 母关苴 1 . 1口乔酉占牛肉膏蛋白陈培养基(附录5-1)。2 .溶液或试剂3%5%石炭酸或2%3%来苏尔溶液。3 .仪器及其它紫外线灯、接种箱、培养箱。四、方法1 .单用紫外线照射(1)在无菌室内或在接种箱内才t开紫外线灯，照射30 min,关闭开关。(2)将牛肉膏蛋白月东平板盖打开15 min,盖上皿盖，37c恒温培养24 h。每次三组。(3)检查每个平板生长的菌落数。如不超过4个，说明灭菌效果良好，否则，需延长照射时间或加强其它措施。2 .化学消毒剂与紫外线照射结合使用(1)在无菌室内，先喷洒 3%5%石炭酸溶液，再用紫外线灯照射 15

32、 min。(2)无菌室内桌面、凳子用 2%3%来苏尔擦洗，再用紫外线灯照射15 min。(3)检查灭菌效果方法同 单用紫外线照射"(3)注意：因紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用， 故不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。五、结果记录两种灭菌效果下表。131805组微生物、化学实验方法学手册紫外线及化学试剂灭菌实验结果处理方法平板菌落数123火菌效果比较紫外线照射3%5%石炭酸+紫外线照射2%3%来苏尔+紫外线照射六、问题紫外线及化学试剂灭菌注意事项有哪些1.2.4微孔滤膜过滤除菌一、目的1 . 了解过滤除菌原理。2 .掌握微孔滤膜过滤除菌方法。二、原理过滤除

33、菌是将含菌液体或气体通过细菌滤器装置，使杂菌受到微孔直径大小限制而留在滤板或滤器上，从而达到除去杂菌目的。此法常用于不宜加热灭菌液体物质，特点是不破坏溶液中各种物质化学成分。如抗生素、血清、疫苗、毒素、维生素和糖类溶液等，可用过滤方法得到无菌溶液。三、材料、仪器 母关苴1 .1口乔酉占牛肉膏蛋白陈培养基（附录 5-1）。2.溶液2%葡萄糖溶液（附录 3-5）。3 .仪器及其它镣子、酒精棉球、0.20 m滤膜、微孔滤膜过滤器、注射器、试管、吸管、玻璃涂棒。四、方法4 .组装、灭菌将0.20 m滤膜装入滤器中，旋紧压平，包装,0.1 mpa、121c灭菌 20 min。5 .连接g同朋拖媚 口卦口

34、 入g他五出将灭菌滤器以无菌操作方式连接于装有待滤溶液（2%葡萄糖溶液）注射器上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞无菌试管（见图8）。图8微孔滤膜过滤器装置6 .压滤将注射器中待滤溶液加压缓缓过滤到无菌试管。注意：压滤时，用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过滤膜。7 .无菌检查无菌操作吸取除菌滤液 0.1 ml于牛肉膏蛋白月东平板上，涂布均匀，37 c恒温培养24 h,检查是否有菌生长。8 .清洗弃去塑料滤器上微孔滤膜， 将塑料滤器清洗干净，并换上一张新的微孔滤膜， 组装包扎, 再经灭菌后使用。注意：整个过程应在无菌条件下严格无菌操作，以防污染。应避免各连接处出现渗透现象。五、结果记录

35、无菌检查结果。六、问题过滤除菌应注意哪些问题 ？1.2.5化学消毒剂的杀菌作用一、目的1 . 了解常用化学消毒剂对微生物的作用。2 .学习测定石炭酸系数的方法。二、原理常用化学消毒剂主要有：重金属及其盐类、有机溶剂（如酚、醇、醛等） 、卤族元素及 其化合物、染料和表面活性剂等。 重金属离子可与菌体蛋白结合而使之变性或与某些酶蛋白 的疏基结合使酶失活， 重金属盐是蛋白质沉淀剂， 或与代谢产物发生鳌合作用使之变为无效 化合物；有机溶剂可使蛋白质及核酸变性，或破坏细胞膜透性使内含物外溢；碘可与蛋白质的酪氨酸残基不可逆结合使蛋白质失活，氯气与水发生反应产生的次氯酸具有杀菌作用；染料在低浓度条件下可抑制

36、微生物生长，染料对细菌的作用具有选择性，革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌对染料更加敏感；表面活性剂能降低溶液表面张力，作用于微生物细胞膜， 改变其透性，同时也能使蛋白质发生变性。各种化学消毒剂的杀菌能力常以石炭酸为标准，以石炭酸系数（酚系数）表示。将某一消毒剂作不同程度稀释， 在一定条件下，该消毒剂杀死全部供试微生物最高稀释倍数与达到 同样效果石炭酸的最高稀释倍数的比值，为这种消毒剂对该种微生物的石炭酸系数。石炭酸 系数越大，说明该消毒剂杀菌能力越强。不同化学消毒剂对不同微生物杀菌能力不同，同一种化学消毒剂对不同微生物的杀菌效果也不一致。因此，使用化学消毒剂进行消毒或灭菌时， 应注意药品浓度及使用时

37、其它因素 的干扰和影响。三、材料、仪器1.菌种大肠杆菌(esecherichia coli),斜面培养 24 h;白色葡萄球菌(staphylococcus albus),斜 面培养18 ho1.1 口乔9牛肉膏蛋白陈培养基(附录5-1)。3 .溶液或试剂4 .5%碘酒、0.1%升汞、5%石炭酸、75%乙醇、100%乙醇、1%来苏尔、0.25%新洁尔灭、 0.005%龙胆紫、0.05%龙胆紫、无菌生理盐水。4.仪器及其它酒精灯、火柴、培养皿、试管、接种环、试管架、吸管、玻璃涂棒、记号笔、镣子、滤 纸片、培养箱等。四、方法1 .滤纸片法测定化学消毒剂杀(抑)菌作用(1)将已灭菌并冷却至 50c左

38、右的牛肉膏蛋白陈培养基倒入培养皿，水平放置待凝固。(2)用吸管吸取0.2 ml培养18 h白色葡萄球菌菌液加入到上述平板，玻璃涂棒涂布均匀。(3)将已涂布好的平板底皿划分成46等份，每一等份内标明一种消毒剂的名称。(4)用镣子将已灭菌小圆滤纸片(直径 5 mm)分别浸入装有各种消毒剂溶液的试管中 浸湿。注意：取出滤纸片时要保证被取出滤纸片所含消毒剂溶液量基本一致，并在试管内壁沥去多余药液。无菌操作将滤纸片贴在平板相应区域，平板中间贴上浸有无菌生理盐水滤纸片作对照(见图9)。(5)将上述贴好滤纸片的含菌平板于37c恒温培养，24 h后取出观察抑(杀)菌圈大小(见图10)。图9贴滤纸片图10圆滤纸

39、片法测定化学消毒剂的杀(抑)菌作用2 .石炭酸系数测定(1)将石炭酸稀释成 1/50、1/60、1/70、1/80及1/90等不同浓度，分别取 5 ml装入相应 试管。(2)将待测消毒剂(来苏尔)稀释成1/150、1/200、1/250、1/300及1/500等不同浓度，各取5 ml装入相应试管。(3)取盛有灭菌的牛肉膏蛋白月东液体培养基试管30支，其中15支标明石炭酸5种浓度，每种浓度3管(分别标记上5、10及15 min);另外15支标明来苏尔5种浓度，每种浓度 3 管(分别标记上 5、10及15 min)。(4)在上述盛有不同浓度石炭酸和来苏尔溶液试管中各接入0.5 ml大肠杆菌菌液并摇

40、匀。注意：吸取菌液时要将菌液吹打均匀，保证每个试管中接入菌量一致。每管自接种时起分别于 5、10和15 min时，用接种环从各管内取一环菌液接入标有相 应石炭酸及来苏尔浓度的装有牛肉膏蛋白月东液体培养基的试管。(5)将上述试管于37c恒温培养，2 d后观察并记录细菌生长状况。细菌生长者试管内 培养液混浊，以“+表示；不生长者培养液澄清，以 表示。(6)计算石炭酸系数值，找出将大肠杆菌在药液中处理5 min后仍能生长，而处理10 min和15 min后不生长来苏尔及石炭酸的最大稀释倍数，计算二者比值。例如，若来苏尔和石 炭酸在10 min内杀死大肠杆菌的最大稀释倍数分别是250和70,来苏尔的石

41、炭酸系数为250/70=3.6。五、结果各种化学消毒剂对白色葡萄球菌的作用能力消毒剂抑(杀)菌圈直径/mm消毒剂抑(杀)菌圈直径/mm2.5%碘酒1%来苏尔0.1%升汞0.25%新洁尔灭5%石炭酸0.005%龙胆紫75%乙醇0.05%龙胆紫1%来苏尔100%乙醇石炭酸系数测定和计算消毒齐ij稀释倍数生长状况石炭酸系数51015/min石炭酸5060708090米苏尔150200250300500六、问题常用的化学消毒剂主要有哪些？主要作用原理及其应用范围?1.3无菌操作和微生物接种技术在微生物研究与应用中，不仅需要分离纯化技术，而且还需要微生物纯培养。在分离、 转接及培养纯培养物时防止其它微生

42、物污染技术被称为无菌技术，是保证微生物学研究正常进行的关键。接种技术是微生物学实验及研究中一项最基本操作技术。接种是用接种工具分离微生 物，或将纯种微生物在无菌操作条件下由一个培养器皿转接到盛有已灭菌并适合该菌生长繁 殖所需要培养基的另一器皿中。微生物学实验所有操作应在无菌条件下进行，即在火焰附近进行熟练的无菌操作，或在接种箱或无菌室内无菌环境下进行操作。根据实验目的及培养方式不同可以采用不同接种工具和接种方法。常用接种工具有接种针、接种环、接种铲、玻璃涂棒、吸管、微量加样器等。常用接种方法有斜面接种、液体接 种、穿刺接种和平板接种等。一、目的学习并掌握无菌操作和微生物接种技术。二、材料、仪器

43、酒精棉、记号笔、标签、 试管、酒精灯、火柴、接种工具、恒温培养箱、锥形瓶、培养皿。三、方法（一） 接种前准备工作接种室应保持无菌状态，定期用75%酒精榛拭桌面、墙壁、地面，或用乳酸、甲醛熏蒸，定期做无菌检查；接种前，要将接种全部物品移入无菌室缓冲间，用75%酒精榛拭干净，并在要接种试管、培养皿、锥形瓶上贴好标签，标签上注明菌种名称、接种日期，有的还要注明培养基名称。 操作人员换上工作服、 鞋并戴口罩及工作帽， 最后将物品送到无菌室 工作台。开启紫外灯进行物品表面消毒灭菌2030 min。（二）接种操作方法1 .斜面接种斜面接种是从微生物菌种试管中挑取少许菌种转接到另一支试管斜面培养基的一种接种

44、方法。具体操作如下。（1）标记接种前将空白斜面试管标记菌种名、接种日期等。（2）点燃酒精灯点燃酒精灯，用75%酒精棉球擦手。（3）接种手持试管将菌种试管及空白试管斜面向上，用大拇指和其它四指握在左手中，使中指位于两试管之间部位，无名指和大拇指分别夹住两试管边缘，管口齐平，管口微向上倾斜（见图11）。旋松棉塞用右手将试管帽或棉塞拧转松动，以利于接种时拔出。接种环灭菌用酒精棉球擦接种环金属杆；右手拿接种环柄，使接种环直立于外焰部位烧灼灭菌，然后斜向横持将接种环金属杆部分来回通过火焰数次（见图12）。201805组微生物、化学实验方法学手册拔棉塞用右手小指、无名指和手掌拔下棉塞并夹紧，试管口迅速在火

45、焰上烧灼灭菌。注意：棉塞下部应露在手外，勿放桌上以免污染。环冷却将灼烧过接种环伸入菌种管内，接种环接触试管壁或没长菌的培养基，使其冷却以免烫死菌体。取菌种环冷却后轻轻取菌少许，接种环慢慢从试管中抽出。注意：带菌接种环不能碰到管壁，取出后不可使环通过火焰。接种在火焰旁迅速将接种环伸入空白斜面，从斜面培养基底部向上部做“z形来回划线。有时也可用接种针在培养基中央划一直线做斜面接种，以便观察菌种生长特点。注意：接种时接种环放平，无用力，否则培养基划破；不要使菌体沾污管壁。塞棉塞灼烧试管口，烘烤棉塞并在火焰旁将试管帽或棉塞塞上。注意：塞棉塞时，不要用试管去迎接棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气。环灭菌

46、接种完毕，接种环放回原处前必须在火焰上彻底灭菌。放下接种环后，用右手将棉塞进一步塞牢，避免脱落。将接种好试管放在试管架上。斜面接种无菌操作过程见图13。48图13斜面接种无菌操作过程1 .烧环 2.拔塞 3.接种 4.加塞 5.灭菌根据微生物和实验目的不同，接种方法有许多。 （1）细菌斜面接种法（见图 14） 点接：把菌种点接在斜面中部， 利于在- 定时间内暂时保藏菌种（见图14-a）。 中央划线：在斜面中部自下而上划一直线，以此比较细菌生长速度 (见图14-b)。 稀波状蜿蜒划线：对于易扩散细菌采用此法(见图14-c )。 图14 细菌斜面接种 密波状蜿蜒划线法：从斜面培养基底部向上部做“z

47、形来回划线。此法能充分利用斜面，以获得大量菌体细胞，细菌接种常采用此法(见图 14-d)。 分段划线：将斜面分成 34段，在23段划线接种前灼烧接种环灭菌，接种环冷 却后沾取前段接种处，再划线以分得单个菌落(见图14-e)。 纵向划线；便于快速划线接种(见图14-f)。(2)放线菌斜面接种多用密波状蜿蜒划线接种，便于观察气生菌丝和抱子颜色。(3)酵母菌斜面接种常用中央划线法接种，用来观察菌种形态和培养特征。(4)霉菌斜面接种常用点接法，点接在斜面中部偏下方处。(5)真菌接种法对于部分真菌，如灵芝等担子菌类， 常用挖块接种法，即挖取菌丝体及少量培养基，移 接到斜面培养基。2.液体接种这是斜面菌种

48、或液体菌种接种到液体培养基(试管或锥形瓶)中的操作方法。(1)斜面菌种接种液体培养基时有两种情况：如接种量小，用接种环取少量菌种送入液体培养基，并使环在液体培养基中搅动，使菌体分散于培养基中。接种后塞上棉塞，将液体培养基轻轻摇动， 使菌体均匀分布于培养基中；如接种量大，可先在斜面菌种管中倒入定量无菌水，用接种环将菌苔刮下，试管口在火焰上灭菌后， 把菌悬液用吸管转入液体培养基。(2)液体培养物接种到新鲜液体培养基，根据具体情况采用不同接种用具：用灭菌吸管、滴管或微量加样器吸取菌液接种。如果用吸管时先将包裹纸稍松动，在其上部1/3长度处截开，在火焰旁伸入菌种管内，吸取菌液，转接到待接种培养基内。灼

49、烧管口，迅速塞好 管。沾有菌的吸管插入原包装吸管纸套内、不能直接放在实验台上，以免污染桌面，放在指 定位置，经高压灭菌后再冲洗；直接把液体培养液摇匀后倒入液体培养基中；利用无菌空气被压后，把液体培养液吸到液体培养基中，如啤酒酵母扩培时，从汉森罐到扩大罐就是采用此法；利用负压将液体培养液吸到液体培养基中，如在抗生素生产中，从种子瓶到种子罐就是采用此法。3.穿刺接种穿刺接种是用接种针从菌种试管沾取少量菌体穿刺到固体或半固体深层培养基中接种 方法。常用来接种厌氧菌，检查细菌运动能力或保藏菌种的接种方法，它只适于细菌和酵母接种培养。具体操作如下。(1)贴标签(2)点燃酒精灯点燃酒精灯，用75%酒精棉球

50、擦手。(3)穿刺接种手持试管旋松试管帽或棉塞灼烧接种针拔塞取菌在火焰旁用右手小指和手掌拔去试管帽或棉塞，将接种针在培养基上冷却， 用接种针尖沾取少量菌种。接种有两种操作方法：一种是水平法，类似于斜面接种法；另一种是垂直法(见图15)。尽管穿刺时被穿刺试管手持方法不同，但穿刺时接种针都必须挺直，并接种到深层固体培养基3/4处，再沿原线拔出，连续接种3针后，烧灼试管口灭菌，盖上试管帽或棉塞，灼烧接种针残菌。注意：穿刺接种时要求手稳，穿刺线要整齐。图15穿刺接种培养将接种试管直立于试管架，适宜条件下恒温培养，一定时间后观察结果。4.平板接种平板接种是用接种环将菌种接至平板培养基上，或用吸管、滴管将一

51、定体积的菌液移至平板培养基一种方法。根据目的不同，平板接种分为以下几种。(1)斜面接平板划线法用接种环自斜面直接取少量菌体菌悬液，接种在平板靠近边缘一点，在平板培养基表面自左至右轻轻划线（见图16）。划线方法分为交叉划线法（见图17-a）和连续划线法（见图 17-b）。具体操作如下：交叉划线法是在平板一边做第一次平行划线34条，转动培养皿约 70。，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平形划线，同法进行第三次划线第四次划线。连续划线法是从平板边缘一点开始。连续做紧密波浪式划线，直到平板中央，转动培养皿180。，再从平板另一边（不烧接种环）同样划线到平板中央。划线完毕后，盖

52、上培养皿 盖，倒置于温室培养。注意：划线时勿划破培养基。图17划线分离图图16平板划线操作图点种法一般用于观察霉菌的菌落。在无菌操作下，用接种针从斜面或抱子悬液中取少许抱子，轻轻点种于平板培养基上，一般以三点（，）形式接种。霉菌抱子易飞散，用抱子悬液点种效果好。（2）液体接平板用无菌吸管或滴管吸取一定体积的菌液移至平板培养基，用玻璃涂棒将菌液均匀涂布于整个平板；或将菌液加入培养皿，再倒入融化并冷至4550 c固体培养基，轻轻摇匀、平置、凝固后倒置培养。此种方法在稀释分离菌种时常用。（3）平板接斜面一般是将在平板培养基分离培养得到的单菌落，接种到斜面培养基， 作进一步扩大培养或保存用。接种前先选

53、择好平板上单菌落，并做好标记。左手拿平板，右手拿接种环，在火焰旁操作，灼烧接种环后将接种环在空白培养基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻，此时左手将平板放下，拿起斜面培养基，进行斜面接种。注意：接种过程中勿将菌烫死，接种时操作应迅速，防止污染杂菌。(4)其它平板接种法根据实验要求不同接种方法不同：如做抗菌谱试验时，可用接种环取菌在平板上与抗生素划垂直线；做噬菌体裂解试验时，可在平板上将菌液与噬菌体悬液混合涂布于同一区域等。四、问题1 .什么是无菌操作技术？无菌操作的关键控制点是什么 ？2 .微生物接种方法有哪几种 ？其要点是什么？第二章、菌种的保藏(岳敏)2.1 菌种保存方法概述定义：菌种保藏

54、(culture preservation),是指将微生物菌种用各种适宜的方 法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定。注意事项：(1)同一菌株应选用两种或两种以上方法进行保藏。(2)只能采用一种保藏方法的菌株或细胞株必须备份并存放于两个以上的 保藏设备中。(3)重要菌种应异地保存备份。(4)菌种保藏设施应确保正常运行，设专人负责管理，定期检修维护。(5)菌种保藏设施应有备用电源，防止断电事故发生。主要保藏方法1 .定期移植保藏法2 .液体石蜡法3 .冷冻干燥法4 .液氮超低温法2.2实验室常用菌种保存方法我们实验室主要采用定期移植保藏法和-80 c低温冷冻保藏法2.2.1 定期移植保藏法本方法适用于大多数细菌和真菌。不同菌种应根据要求选择合适的培养基(如乳酸菌用mrs培养基，大