southern杂交实验方法和步骤

1、废旧胶片方形果盘三、主要试剂etection starter kit i®碱，柠檬酸钠，马来酸rnase a真菌基因组提取试剂盒dig-high prime dna ldna makerwhatman 3mm滤纸 尼龙膜 吸水纸 平板lnaoh, 1.5mol/lnacl；和液：0.5mol/ltris-hcl (ph=7.5), 1.5 mol/lnacl；southern杂交实验方法和步骤一、主要仪器：离心机 恒温水浴锅orbital shaker 恒温摇床poner pac300核酸电泳仪 versadoc凝胶成像系统 水平摇床hl-2000 hybrilinker 分子杂交仪

2、 烘箱二、主要材料naoh, nacl四.试剂准变性液crnehol/lnacl, 0.3 mol/l柠檬酸钠，浓盐酸调节ph至7.0；丁竄100 ml20xssc溶液，灭菌去离了水定容至1l；2xsgc+0.01%sds：取 100 ml20xssc 溶液,10ml10% sds,灭菌去离子水 定容至1l；0.5xssc0.01%sds：取 25ml20xssc 溶液，10ml10%sds,灭菌去离了水 定容至1l；洗涤缓冲液:0.1 m 马来酸,0.15mnacl, ph 7.5, 0.3% (v/v) tween 20； 马来酸缓冲液：0.1 m马來酸，0.15mnacl,用naoh (

3、固体)调节ph值至 7.5；检测缓冲液：0.1 tris-hcb 0.1 mnacl, ph 9.5；封阻溶液：将dig试剂盒内的6号瓶置于37°c水浴锅小预热，充分溶解后， 取12ml,与108ml马來酸缓冲液混匀备用（新鲜配制，立即使用）；抗体溶液：将dig试剂盒内的4号管loooorpm高速离心5min,取4（il上清, 加入20ml封阻溶液小，备用；底物显色液：取20ml检测缓冲液，避光加入400yldig试剂盒内的5号管。管iin colum 中加入 600|il wash buffer, loooog 高速离心 30s,弃去管中pi,250 rpmx28°c培养

4、 2 d； 滤的囲丝加液氮速冻后研磨成粉末， 心管屮，按照真菌基因组捉取试剂其充分混匀，再加入4pl的100mg/ml的 加浴锅坪温浴半小时；、混匀后冰浴5min后14000g高速离心3min； 噺的 1.5ml 的 pe 管中,加入 750|il e binding buffer, 传移到spin colum中,6000g离心lmin,弃去管中液体;luai 屮加入 500pl g binding buffer, loooog 高速离心 30s,弃去液体； 重复上一步； 再次将spin colum于loooog高速离心lmin,并将spin colum放置在一个 新的1.5ml离心管上； 室

5、温静置3min,向spin colum小加入40|il灭菌去离子水，室温放置lmin, 12000g高速离心imino检测捉取得到的基因组的质量和浓度。七、southern biot验证敲除转化子 基因组酶切：将敲除转化了和野生型菌株的基因组用xi和x2双酶切，反应体系如210xfd buffer4.5 |ilxi2 plx22卩1样品dna6囲ddh2o水至45 pl总体积45 |1l上进行检测，判断酶37°c恒温反应2h。 电泳分离 酶切1.5 h后，取2pl酶切dna样品于1%的塚fl旨櫛切程度。当酶切充分吋，制备1%的琼脂糖电就娜q样昭中加入1 oxloading buffe

6、r, 于30-40v稳压电泳4-5h （包括dna ma切下样品及质粒部分的凝胶，剩余 mg/ml澳化乙锭（eb）的100 ml 1 电泳凝胶预处理浸没凝胶），室温，于水平摇床上低速晃动151）将凝胶浸于适量变性腋min,并重复一次；浸湿2）再将凝胶3）将撈4）在3廿妙寸照质粒），电泳完成之后，则单独浸泡在添加了 10|il 10 r中染色30 min。（1比0中，室温，轻轻晃动10 min； 中和液中，室温轻轻晃动15 min,并重复一次;缓紳液中平衡凝胶10 min以上。?大小合适（19cmx20cm）的 whatman 3mm 滤纸，经 20><ssc buffer 妳比凝胶

7、稍大的支撑平台上，两端浸入20xssc buffer,形成一个“桥s2）将与凝胶等犬的滤纸i放在搭好桥的滤纸上，再将凝胶放置于滤纸i上 （凝胶背面向上放置），切掉左上角，注意两者之间杜绝气泡；3）裁剪尼龙膜，与凝胶等大，放置在凝胶上，利用玻棒使其平整，杜绝气泡 出现；4）将三张与膜等大的whatman 3mm滤纸放在膜上，利用玻棒使其平整后， 放置一叠与凝胶大小一致的吸水纸，并用玻璃板作为放置重物的平台，压在吸水 纸上，再添加500 g左右的舷码；5）用塑料隔板封闭凝胶四周，以防止吸水纸通过接触凝胶的边缘而直接接触 平板造成液流的短路，6）转移3小时后，将浸湿的吸水纸换掉，添加干燥的吸水纸，整

8、个转移过程 为18-24 h,期间根据吸水纸湿润情况换纸1-2次；7）dna在膜上的固定：将完成转移后的尼龙膜置于2xssc缓冲液中短暂洗 涤lmin,放置于两张滤纸中，120°c烘箱中烘干固定30min。 杂交1）预杂交：将尼龙膜上没有固定dna的一面贴瓶壁，放入杂交 42°c预热的hyb高效朵交液（hyb-100） （10 ml/100 mm2）,置于42莎 朵交2h；2）标记探针：用引物tf和tr进行pcr扩增制备探借照dig试剂盒的操作说明标记探针，并用pcr产物纯化试剂盒纯化探针;3）探针变性：将纯化后的探针沸水屮水浴变性2 min （现用现备）；4）朵交：弃去预朵交液，往朵交瓶中： 2）,再加入6（1l变性好的探针（）2gg/ 42°c杂交过夜。 洗膜及dig信号检测1）杂交后，室温下,22）将 o.lxssc+o.gds 漪瓶中，65°c洗涤153）将膜取出，液体；4）一加5声物，再按加入20 ml洗涤缓冲液中轻轻晃动5 min,倒掉断液反应30 min （在摇床上轻轻摇动），倒掉液体;即置于冰上，冰浴高效朵交液（10ml/100 朵丿交液）,混匀，置于杂交炉小2痊sc+0.1%sds洗膜5min,重复一次；65°c水浴锅中预热后，加入20 ml进杂交otil含有抗体的缓冲液，摇动孵育30 min后