地塞米松诱导体外培养星型胶质细胞凋亡机制的研究

1、地塞米松诱导体外培养星型胶质细胞凋亡机制的研宄作者：金红艳欧阳铭戴冀斌 【关键词】地塞米松；星型胶质细胞；凋亡；p53；bax； b cl2摘要：目的：探讨地塞米松引起体外纯化培养的大鼠大 脑皮质星型胶质细胞凋亡的机制。方法：不同浓度的地塞米 松与纯化培养的大鼠大脑皮质星形胶质细胞共同孵育24小 时后，用免疫细胞化学方法检测p53、bax及bcl2在星型胶 质细胞内的表迗情况，表迗的强弱用平均光密度表示。结果: p53和bax的表迗随着地塞米松浓度的升高而增强，与对照 组比较，各组均有极显著性差异，bcl2的表达随着地塞米松 浓度的升高先是增强而后减弱，与其他组比较10-3组有显 著性差异。结

2、论：p53和bax的表达增强可能是大剂量地塞 米松引起星型胶质细胞凋亡的主要因素。关键词：地塞米松；星型胶质细胞；凋亡；p5 3; bax；bcl2在哺乳动物的中枢神经系统内约有一千亿个神经元，而 在这些神经元的周围又约有十倍以上的胶质细胞存在，其中 以星型胶质细胞数量最多。传统观点认为，星型胶质细胞只 对神经元起结构和功能上的支持作用，但近年来越来越多的 证据表明，星型胶质细胞在中枢神经系统内扮演着更为积极 和更为重要的角色，这也是胶质细胞成为神经领域研究热点 的一个直接原因。糖皮质激素(g lucocorticoid,gc)是一类 具有神经活性的甾体激素，已有许多实验证实gc对神经元 的生

3、长、分化和凋亡都起重要的调节作用，但对胶质细胞的 影响报道不多。已有报道证实大剂量的地塞米松可诱导体外 培养的星型胶质细胞凋亡1，为进一步探讨其机制，我们 做了如下研究。1材料和方法11材料新生wistar大鼠6只；dmem/f12培养基；胎牛血清和 小牛血清；l谷氨酰胺；地塞米松；兔抗p53、bax、bcl2抗 体；sabc免疫组化试剂盒及dab试剂盒；24孔培养板； hpias1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统；sl2300二 氧化碳培养箱；ufxii光学显微镜。12方法121星形胶质细胞的纯化培养将出生广2天的新生 wistar大鼠用75%的酒精浸泡消毒后，采用无菌方法迅速取 出大

4、脑，用dhanks液清洗并剔除脑膜和血管，取大脑皮质， 将组织剪碎为lmm3大小，用胰蛋白酶37 °c消化数分钟， 过滤，离心，去上清，加入dmem/f12完全培养基制成细胞悬 液。计数后按5x104/cm2接种于培养瓶，加入dmem/f12完 全培养基，在37°c、5%c02培养箱中培养9天，第9天将培养瓶置于恒温旋转摇床上(240rpm)，摇18小时，去掉含有 悬浮细胞的培养液，用dhank s液清洗3次，进行传代培养 即得纯化的星形胶质细胞2。经免疫细胞化学方法检测， 95%以上的细胞gfap免疫反应为阳性。122实验分组在24孔培养板的每一孔内放入一张lcm2 消毒

5、过的玻片，涂上多聚赖氨酸，然后将星型胶质细胞分组 种在坡片上。纯化的星形胶质细胞被分成1个对照组和3个 实验组，每组3个样本。对照组不加地塞米松，其它3组分 别加入终浓度为10-5、1 0-4、10-3mol/l的地塞米松。在 37°c、5%co2条件下，继续培养24小时，然后作免疫细胞化 学分析。123免疫细胞化学染色将各组细胞爬片进行sabc法免疫 细胞化学染色。每一培养孔中的细胞爬片经固定、封闭非特 异性抗原和消除内源性过氧化物酶等处理后，首先加入特异 性抗体，4°c孵育72 h。然后依次加入生物素化羊抗兔igg， 37°c、lh; sabc 复合物，37

6、°c、lh; dab 显色 5min。每步 间均用pbs充分洗涤。所有爬片经脱水、透明、中性树胶封 片后，光镜下观察、摄片。以正常兔血清和pbs缓冲液替代一抗作对照染色，结果 为阴性。124图像分析用hpias1000高清晰图像分析系统进行阳性细胞计数及平均光密度分析。所得数据应用spss统计软 件，以方差分析进行统计分析，p定为差异有显著性，数据 以均数土标准差表示。2结果21形态学观测结果p53 对照组：可见少数免疫反应阳性细胞，反应产物 呈棕黄色，主要见于胞核。10 -5组：免疫反应阳性细胞增 多，反应产物呈棕黄色，见于胞核，胞浆淡染。10 -4组： 免疫反应阳性细胞明显增多，

7、反应产物呈棕黄色，见于胞核， 胞浆也有表迗。10-3组：大多数细胞呈免疫反应阳性，反应 产物呈棕褐色，胞核胞浆界限不清。bax对照组：细胞大小形态一致，核膜着色呈棕黄色， 胞核中央有透亮区，胞浆淡染。10-5组：免疫反应产物颜色 加深，细胞形态变化不大。10 -4组：颜色进一步加深，细 胞形态无太大变化。10-3组：免疫反应产物呈棕褐色，胞浆 染色明显加深，少数细胞体积缩小，核浓缩、深染。bcl2对照组、10-5组、10-4组这3组细胞大小形态 基本一致，细胞着色变化也不大，胞核胞浆均有着色，反应 产物呈棕黄色。10-3组：与前3组比较，10-3组细胞染色 明显变浅，尤其是胞浆明显淡染。图1对

8、照组p53的表达（x 200）® 210-5 组 p53 的表迗（x200）22图像分析结果221地塞米松对p53表达的影响不同浓度地塞米松与纯化的星型胶质细胞共同孵育24小时后，p53的表迗随着地塞 米松浓度的升高而逐渐增强，与对照组比较各组均有极显著 性差异，各浓度组之间两两比较也有极显著性差异，见表1。222地塞米松对bax表达的影响不同浓度的地塞米松与 纯化的星型胶质细胞共同孵育24小时后，bax的表迖也随着 地塞米松浓度的升高而增强，但其幅度有所减缓，与对照组 比较各组均有极显著性差异，各浓度组之间两两比较有显著 性差异，见表1。223地塞米松对bcl2表达的影响不同浓度的

9、地塞米松与 纯化的星型胶质细胞共同孵育24小时后，bcl2的表迗变化 较复杂，先是10-5组呈现增强趋势，从10-4组开始出现减 弱趋势，至1 0-3组出现明显减弱，其中对照组、10-5组、 10-4组之间经过统计学分析没有显著性差异，而10-3组与其 他各组比较有显著性差异，见表1。表1星型胶质细胞经dex 处理后p53、bax、bcl2表迗的平均光密度224地塞米松对bax与bcl2表迗比值的影响把每一浓度 组bax表达的平均光密度与同组bcl2的平均光密度作一比 值，我们发现随着地塞米松浓度的升高，b ax/bcl2值也逐 渐升高，而10-3组最为显著，见表2。表2星型胶质细胞经 dex

10、处理后bax与bcl2平均光密度比值3讨论细胞凋亡与细胞坏死完全不同，它是一种积极意义上的 细胞死亡，它不但在病理条件下而且在多种生理条件下发挥 着重要的作用3,4。有大量证据表明，在胚胎发育过程中 发生的神经细胞的死亡大多与凋亡有关5。另外，局部 缺血、兴奋毒性作用、脑外伤和慢性退行性病变等都可促使 凋亡的发生4,6。已有报道证实，大剂量的地塞米松可引 起体外纯化培养的星型胶质细胞凋亡1，但其确切机制尚 不清楚。为了探讨其中的机制，我们设计了本实验，检验地 塞米松是否引起了 p53、bax及bcl2表达的变化。我们发现， p53的表达随着地塞米松浓度的升高而逐渐增强，bax的表 迗也随着地塞

11、米松浓度的升高而增强，但其幅度有所减缓， bcl2的表迗先是10-5组呈现增强趋势，从10-4组开始出现 减弱趋势，至10_3组出现明显减弱，这样导致b ax/bcl2值 逐渐升高，10-3组最为明显，这可能是10-3组引起星型胶 质细胞凋亡的直接原因。众所周知，很多原因比如缺血、放射线以及兴奋毒性作 用都可以引起p53表达的增强，最终导致神经细胞凋亡2, 7op53基因编码的产物，即p53蛋白可以调节bax的表达， 而bax可能是介导p53依赖的神经细胞凋亡的主要因素8。 另外，whiteetal发现在敲除掉bax基因的小鼠大脑中很难 找到自然死亡的神经细胞9。有人发现p53可以通过降低bc

12、l2的表达来间接地引起细胞凋亡10。bax可以通过与b cl2形成同型或异型二聚体来促进凋亡的发生11，因此，bax与bel 2比例的变化就可以决定某些细胞是存活或是死 亡11。在本实验中，地塞米松引起p53持续升高，bax也 有类似的表现，而bcl2是先升后降。总之，p53、bax、bcl2 经过地塞米松作用后其表迗都发生了显著的改变，尤其是 10-3组，这提示它们在地塞米松诱导星型胶质细胞凋亡的过 程中发挥着重要的作用。bax表迗增强可能是p53表迗增强 的结果，因为p53可以促进bax的转录和翻译10。另一 方面，p53表迗的增强又可能抑制了 bcl2,使它表达下降10 但是细胞本身可能

13、存在一种抗凋亡的补偿机制12，使得 在bax表迗增强的情况下bcl2也加强表达，以对抗bax的 促凋亡作用，但这种抗凋亡作用是有一定限度的，因此，bcl2 的表达先增强后减弱。ba x/bcl2值因此进行性升高，这可 能直接导致10-3组星型胶质细胞凋亡。地塞米松引起p53和bax表迖增强可能是通过作用于胞 浆内的糖皮质激素受体开始的。报道地塞米松能引起在体纹 状体和海马神经元凋亡，但这种作用可被糖皮质激素受体阻 滞剂ru38486阻断13。类似的报道还有，karine发现地 塞米松能诱导脾b淋巴细胞凋亡，但同样可被ru486完全阻 断14。地塞米松与胞浆内的糖皮质激素受体结合后，受 体的构象

14、发生改变，激素受体复合物进入核内与激素反应元 件gre结合，可能激活或抑制某些基因的转录，最终导致p53 和bax表达增强，其确切机制有待进一步研究。bax能与自身形成二聚体，这种二聚体在线粒体膜上可以组成离子通道15，线粒体膜内外的小分子和离子可通过该通道进行被 动扩散，结果引起线粒体膜电位的改变，去极化，细胞色素 c释放入胞浆，继而引起与细胞凋亡有关的一系列蛋白酶的 活化，最终导致细胞的凋亡。参考文献1王珍，刘仁刚，周洁萍，等地塞米松诱导培养的大鼠 大脑皮质星型胶质细胞凋亡.中国组织化学和细胞化学杂志，2002, 1 1： 2822852crumrin e,thomas,andmorga

15、n,attenuationofp53 odflow. metab,1994, 14： 887891expressionprotects icdamageintransgenagainstfocalischem icmice,j. cereb. bio3kerr, wyllie,andcurrie,a poptosis：abasicbiologicalphenomenonwithwiderangingimplicationsintissueki netics,br. j. cancer ,1972， 26 2392574 leist,m. andnicoter a,p. apoptosis,ex

16、ci totoxicity, andneur opathology, exp. cel ires, 1998,239： 1832015raff,barres,burne,etal. programmedcelldeathandthecontrolofcellsurvival： lessonsfrom thenervoussystem, s cience, 1993,262： 69 5700 ntation, neuroscien ce, 1996, 74： 114311 606thompson,apenesisandtreatment 1995,267:145614627hughes,alex

17、i,t.itotoxiclesionofracacidinducesexpresrnaandproteinandp5ndgadd45inbrainareoptosisinthepathog ofdisease,science,yoshida,t,etal. exc tbainwithquinolini sionofp53messenger induciblegenesbaxa asshowingdnafragme8xiang,h. ,kinoshita,y. ,knudson, , etai. baxinvolvementinp53mediatedneuronalcelldeath, j. n

18、eu rosci, 1998,18:1363 13739white,kellerpeck,knudson,widespreadeliminationof naturallyoccurringneuronaldeathinbaxdef icientmice , j. neurosci, 1998,1 8： 14281439 lomiya shita,t. , krajewski , s. , krajewska,m. , tumorsuppressorp53i saregulatorofbcl2a ndbaxgeneexpressio ninvitroandinvivo, oncogene, 1994,9： 17 991805lloltvai,mi 11iman,andkorsme yer,bcl2heterodime rizesinvivowithaconeservedhomolog. bax,thataccelerat