促甲状腺素化学发光免疫定量检测试剂盒的研制11(精)

1、促甲状腺素化学发光免疫定量检测试剂盒的研制11(1)作者：王青，王缦，魏东芝，陈寒柏，张黎明【摘要】目的：研制人血清中促甲状腺素(TSH 的化学发光免疫检测试剂盒。 方法：采用辣根过氧化物酶标记的抗 TSHB亚单位特异性单克隆抗体 (mAb),与固相包被的抗 TSHa 亚单位的另一 mAb 配对,以鲁米诺作为底物,采 用两步法建立了双位点夹心法人血清 TSH 的化学发光免疫定量分析法。结果：该方法灵敏度为0.0788 mIU/L,批内 CV 平均为 4.7%,批间 CV 平均为 8.4%, 平均回收率为 93.05%。该检测与 LH、FSH 和 HCG5 交叉反应。部分实验样品 的测试结果显示

2、该试剂与国外同类试剂(雅培 architect i2000)的测定结果明显相关(r = 0.984)。结论：该方法具有较高的灵敏度、重复性和准确度，与其他同类产品相比简便、快捷、成本低，适于临床检测和科研应用。【关键词】促甲状腺激素(TSH 化学发光免疫分析法 试剂盒促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone, thyrotropin, TSH)是一种由垂体前叶分泌的糖蛋白激素，由a和B2 个亚基组成，相对分子质量(Mr)为 28000 1 。 TSH 本身受下丘脑分泌的 TSH 释放激素 TRH 的调控，TSH 的主要 生理作用是调节甲状腺激素的合成与分泌，血液中甲

3、状腺激素水平与腺垂体分 泌 TSH的量之间有负反馈抑制关系2。甲状腺功能改变时，TSH 的波动较甲状 腺激素更迅速且明显，是反映下丘脑垂体 甲状腺轴功能的敏感指标，因此采用灵敏度高的 TSH 免疫分析法具有重要的意义。化学发光免疫分析(chemiluminescent immunoassay, CLIA)是一种灵敏的免疫分析方法，在免疫诊断试剂研制中已得到了广泛的应用3。本研究根据化学发光免疫分析法的原 理研制了血清 TSH 的检测试剂盒，与国内外同类产品相比具有简便、快捷、成本低等优点。1材料和方法1.1材料 TSH 单克隆抗体(mAb)、TSH 标准品抗原和辣根过氧化物酶(HRP 为 Si

4、gma 公司产品，光免板为 Thermo Electron 公司产品，化学发光底 物为BioRad 公司产品。1.2方法1.2.1标准品的配制将 TSH 抗原标定后溶于小牛血清中，配制成含0.1, 1,5, 20, 100 mIU/L的标准溶液。1.2.2抗体包被板的制备将 100 卩 L 含 TSH mAb（ 0.5mg/L ）的 pH9.6碳酸盐缓冲液加至包被板中,37C包被 2 h,再用含 10 mg/L BSA 的 0.01 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液于 37C封闭 2 h 后晾干备用。1.2.3酶标记物的制备TSH 的酶标记物采用过碘酸钠法制备,然后经0.01 mol/L p

5、H7.4 磷酸盐缓冲液透析过夜后,加入等量的甘油于-20C保存备 用。1.2.4检测方法将 50 卩 L 待测样品或标准品加入包被 TSH 的光免板中，37C温育 30 min,弃反应液，用洗涤液 （含 0.5 mg/L Tween20 的 0.01 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液）洗 5 次，加酶标记物 50 卩 L, 37C温育 30 min 后 同样用洗涤液洗 5次，然后加入发光底物于 510 min 内测定各孔的发光值 RLU 样本中的 TSH 浓度依据由标准品 TSH 浓度和对应的 RLU 建立的数学模型进2结果2.1动力学性质 在 鲁米诺发光体系中，将不同量的免疫复合物加入发光

6、液中，发光强度（RLU 随反应时间而变化。10 min 后 RLU 接 近峰值，在 515 min 内 RLU 较为稳定，随后开始缓慢下降。2.2反应条件优化2.2.1加样量对 RLU 的影响 样本和酶标记物的加样量分别为 50 卩 L 和 100卩 L 考查标准品（0、0.1、1、5、20、100 mIU/L ） RLU,发现加样 量为 100 卩 L 与50 卩 L RLU 相差不大，说明 50 卩 L 的加样量反应能达到平衡（图 1）。图 1加样量对 RLU 的影响（略）2.2.2反应模式对 RLU 的影响 采用二步法。第一步：加入标准品和待 测样品后，将反应体系在 37r分别温育 15

7、、30、45、60 min;第二步：加 入酶标记抗体后，将反应体系在 37E分别温育 15、30、45、60 min。结果 表明温育时间为 30 min 时反应皆能达到平衡（图 2）。图 2 温育时间对 RLU 的影响（略）A:第一步温育时间对 RLU 的影响；B:第二步温育时间对 RLU 的影响.2.3 稳定性将试剂盒放置于 37E6 d 后，比较与放置前参考标准品各点 RLU 值，参考标准品各点 RLU 值未见明显降低，且本底发光值无明显升高，表明试剂盒标准曲线无明显漂移，满足稳定性要求。本篇论文由网友投稿，读书人只给大家提供一个交流平台，请大家参考，如有 版权问题请联系我们尽快处理。方法

8、学评价2.4.1 标准曲线与灵敏度 在设定的免疫反应和发光条件下 , 以标准血 清的浓度（0100 mIU/L ）制作的标准曲线见图 3。同时测定 20 个零标准，用 零标准均值加上 2 倍标准差 , 计算出此方法的灵敏度为 0.0788 mIU/L 。图 3 TSH 标准曲线（略）精密度 取低（4.44 mIU/L）、中（ 1 9.45 mIU/L）和高（79.2 3 mIU/L）3 种 TSH 浓度各重复测定 10 次,测定批内 CV 分别为 6.2%、3.3%和 4.6%,平均为4.7%。隔日分别进行 5 次独立试验,测批间 CV 分别为 8.3%、 7.6%和 9.3%, 平均为8.4

9、%。准确性 在已知 TSH 浓度的血清中加入 3 种不同浓度的标准血清 测定加入回收率为 93.05%。将 TSH 浓度为 44.42 mIU/L 的血清用标准零血清分 别按 1/2、1/4、1/8、1/16 稀释，测量各稀释浓度的 TSH 含量，测定稀释回 收率为 99.86%。特异性在已知浓度的血清样品中加入不同浓度的LH FSH 和HCG 后,对 TSH 的测定无干扰。与进口试剂的比较 将研制的 TSH CLIA 定量检测试剂盒与 Abbottarchitect i2000 全自动化学发光系统共同对 30 例正常人、 20 例甲亢 及 80 例甲低临床标本进行检测 , 通过数据分析 ,

10、得出两个检测系统所得数值具 有明显相关性 （图4）。图 4 与 Abbott 全自动化学发光系统相关性曲线（略）3讨论血清促甲状腺素定量检测的方法主要有放射免疫法、 酶联免疫法、 时间 分辨荧光免疫法和化学发光免疫法等几种 4 。考虑到目前化学发光和时间分辨 荧光分析仪器几乎全部为国外厂商生产 , 而绝大多数厂商采用仪器加试剂盒捆 绑销售的垄断模式 , 并在仪器中人为设置排它性检测程序 , 从而抬高了配套试 剂盒价格 , 增加了检测成本 , 所以本工作旨在开发国产低价、 稳定、 通用的 人血 TSH CLIA 试剂盒。首先对读数时间进行了动力学研究，发现其在 515 min 内 RLU 处于平

11、台期，反应时间选择 10 min。其次对反应条件进行了实验摸索 在不同的温育时间和加样量的条件下，各 RLU 值相差不大，因此选择了 50 卩 L 的加样量与两步共 1 h 的反应时间。我们研制的 TSH 化学发光免疫测定试剂盒通过方法学鉴定表明无论是灵敏 度、准确性、 特异性等技术指标均达到了临床诊断的要求 5; 同时该方法具 有操作方便 ,反应时间短和成本低等优点 , 具有较广阔的市场应用前景。【参考文献】Hay ID, Bayer MF, Kaplan MM, et al. American thyroid associationassessment of current free thyroid hormone and thyrotropin measurements andguidelines for future clinical assaysJ. Clin Chem, 1991, 37(11): 2002-2008.尹东光 , 贺佑丰 , 刘一兵 , 等 . 促甲状腺激素化学发光免疫分析的研 究J.分析化学研究报告,2004, 7(32) : 893-896.叶成果 . 促黄体生成素化学发光免疫定量