环境污染生物监测课件

1、水质水质微型生物群落监测微型生物群落监测PFU法法GB/T 12990-91 （1）本标准的野外监测适用于淡水水体，包括湖泊、水库、池塘、大江、河流、溪流。（2）本标准的室内毒性试验适用于工厂排放的废水、城镇生活污水、各类有害化学物质。（3） 本标准适用于综合水质评价。 c c、群落生境：、群落生境：不同的解落生活在不同的生境中，不同的生境有不同的群落。PFU微型生物群落随采样点的不同生境而异。 d d、分类单元：、分类单元：以形态差异为主的分类学上的种(Species)，无法确定个别种的学名时，可用属(Genus)、科(Family)或类群(Group)代替，只需把形态不同的种类分清。（1）

2、PFU的制备：将PFU切块506575，使用前用蒸馏水浸泡1224h，挤去水分，用细绳束腰捆紧，留出1520 cm长的线头便于悬挂。1、监测用材料及设备 a.55mm260mm540mm的搪瓷盘或塑料盘。b.玻璃培养柜，可隔成三层。层距660mm。每层装40W日光灯。a.可调恒流稀释装置1台。b.直径400mm、高200mm的有机玻璃平底圆形试验槽，设置均匀分布6个直径10mm的出水孔。c.母液罐。d.搪瓷捅1个，用于稀释水。 A 配有相差镜头的生物显微镜一台。B 毒物测试用试剂和仪器。(依测试毒物而定)C 测叶绿素a含量常规方法中用的试剂和仪器。(90丙酮、抽滤装置、721分光光度计、孔径0

3、.71.0m玻璃纤维滤膜)。 D测去灰分干重常规方法中用的试剂和仪器。(烘箱、马烘炉、10mL坩埚、分析天平)。野外监测（1）PFU的挂放有三种： a.漂浮式(图1)：两边浮桶用石块固定位置后，用绳索把两个浮桶牵住。 b.沉式(图2)：把PFU绑成一束，用石块下沉，用重物系一束PFU抛向水中，不得把PFU沉在底部，以免影响污染监测的效果。c.分散式(图3)：在同一采样点分散几处挂放，每处只放24个PFU。绳端固定在岸边。PFU曝露天数根据工作要求而异。常规监测曝露不能少于1天。评价水质要做一个完整的群集曲线，曝露时间规定1，3，7，11，15，21，28天时采样。静水和流水分别在28、15天结

4、束。 稀释水：用没有污染的天然水源或去氯自来水，加热到60维持20min，以便杀死水中的生物。在冷却过程中自然曝气，备用。种源(Epicenter)PFU：种源PFU是指事先在无污染水体中已放了数天(流水3天，静水1520天)的PFU，其上已群集了许多微型生物种类，接近平衡期的、未成熟的群落。未成熟群落要比成熟群落(平衡期后)对污染的毒性反应敏感得多。毒性试验0天时，须镜检种源PFU。采样时从挂放的PFU随机取两块，供生物平行观察。如需进行叶绿素a和去灰分干重的测定，则取第三块PFU。采集的PFU块分别放在塑料食品袋中带回实验室。袋中不要加水。回室后，带上薄膜塑料手套，把PFU中的水全部挤于烧

5、杯中，把袋中的水也倒入。观察一个样品挤一个。全部镜检样品必须在48h内完成。 静态毒性试验的布局：在试验盘的两端各绑45个空白PFU，并使PFU吸满受试水。于盘子中央再挂放种源PFU。各空白PFU须与种源PFU距离相等(图4)。各浓底梯度均应有两个试验盘。置于玻璃培养柜内，40W日光灯保持试验盘光强10002000lx。白天开灯12h，天黑关灯12h，成为一个实验室微生态系统(也称微宇宙)(图5)。 动态毒性试验的布局：把盛稀释水的和盛母液的容器出水管分别引入恒沉稀释装置内进行配比，然后再把恒流稀释装置的出水管清流到试验槽的中央(如图6)，试验期间仍须按时分析浓度梯度。 采样：在静态试验中按1

6、，3，7，11，15天采样，在动态试验中按0.5，1，3，7，11，15天采样。采样是随机的。小心地解开PFU绳索，从试验盘(槽)中提出，挤出溶掖于烧杯后，仍将PFU小心放回原地绑好，做好记号表示此PFU已用过。试验结束后对各盘中种源PFU进行镜捡。 镜检时用细吸管从烧杯底部吸3滴水样于载玻片上，盖上22mm32mm盖玻片。按高、中、低倍镜顺序仔细全片检查三遍原生动物种类。要求看到85种类。若要求种类多样性指数(Species diversityindex)，则须定量计算。把水样摇匀，吸0.1mL水祥于0.1mL计数框内，全片进行活体计数。原生动物镜检 群集过程是根据MacArthurwils

7、on岛屿区系平衡模型修订公式：式中：Stt时的种数； Seq平衡时的种数；G群集速度常数；T90达到90Seq所需时间， H污染强度。St= Seq (1- e-Gt)美国弗吉尼亚工程学院及州立大学环境研究中心的Cairns 等于1969 年创立 中国科学院水生生物研究所沈韫芬在20 世纪80 年代初引进此种新技术并加以改进与完善 1991年我国颁布了水质 微型生物群落监测 PFU法国家标准（GB/T12990-91）微型生物群落在水生态系统中客观存在。用PFU浸泡水中，曝露一定时间后，水体中大部分微型生物种类均可群集到PFU内，挤出的水样能代表该水体中的微型生物群落。 已证明原生动物(包括植

8、物性鞭毛虫、动物性鞭毛虫、肉足虫和纤毛虫)在群集过程中符合生态学上的MacArthurWilson岛屿区域地理平衡模型，由此可求出群集过程中的三个功能参数(Seq、G、T90)。 原生动物群落的稳定性及其对环境变化原生动物群落的稳定性及其对环境变化的反应特征符合生态学的一般规律。的反应特征符合生态学的一般规律。环境条件变化会改变原生动物结构与功环境条件变化会改变原生动物结构与功能特征能特征 污染不严重或非持久, 在受损的水域生态系统中原生动物群落会进行自我调节, 最后有可能恢复到接近于原有的正常平衡状态。 1 1）、种类、）、种类、 结构、分布特点克服高等结构、分布特点克服高等动物在实验室的设

9、备选择及野外采集样动物在实验室的设备选择及野外采集样品方面的不足品方面的不足 2 2）、体积小与它们所生存的环境直接）、体积小与它们所生存的环境直接接触接触, , 对环境变化对环境变化( (如水体污染如水体污染) ) 具有更具有更短、更迅速的反应时间短、更迅速的反应时间 3 3）、生长繁殖速度快）、生长繁殖速度快, , 能够在较短的时能够在较短的时间里测试出毒物对其在几个世代水平上间里测试出毒物对其在几个世代水平上生长、繁殖、代谢及其它生理生化特性生长、繁殖、代谢及其它生理生化特性的影响的影响4 4）、）、绝大多数原生动物种类为世界性分绝大多数原生动物种类为世界性分布布, , 不受季节和地区差

10、异的限制。不受季节和地区差异的限制。 方法简单方法简单, , 易于操作易于操作, , 不受水深、底质和流速的不受水深、底质和流速的影响影响 PFU PFU 孔径小孔径小(100(100150 um) , 150 um) , 大型的浮游动物和其大型的浮游动物和其它无脊椎动物无法入侵到它无脊椎动物无法入侵到PFU PFU 内内, , 因此可以采集因此可以采集到水体中绝大多数原生动物种类到水体中绝大多数原生动物种类PFU PFU 方法可按照实际需要挂放于水体中一段相方法可按照实际需要挂放于水体中一段相应的时间因而克服了瞬时采样的缺陷应的时间因而克服了瞬时采样的缺陷利用生物受到污染物质危害或毒害后所产

11、生的反应利用生物受到污染物质危害或毒害后所产生的反应或生理机能的变化，来或生理机能的变化，来评价水体污染状况评价水体污染状况，确定毒物安确定毒物安全浓度全浓度的方法称为生物测试法。的方法称为生物测试法。 按水流方式：静水式和流水式按水流方式：静水式和流水式按按测试时间分类测试时间分类：急性试验和慢性试验：急性试验和慢性试验按按受试活体受试活体：水生生物和发光细菌等：水生生物和发光细菌等藻类生长抑制试验溞类活动抑制试验鱼类急性毒性试验发光细菌的急性毒性试验种子发芽和根伸长的毒性试验1、水生生物毒性试验、水生生物毒性试验金鱼金鱼绿藻绿藻褐藻褐藻草鱼草鱼图图 可用于水生生物毒性试验的部分鱼类和藻类可

12、用于水生生物毒性试验的部分鱼类和藻类鳙鱼 鲢鱼 要选择无病、行动活泼、鱼鳍要选择无病、行动活泼、鱼鳍完整舒展、食欲和逆水性强、完整舒展、食欲和逆水性强、体长（不包括尾部）约体长（不包括尾部）约3 cm的的同种和同龄的金鱼。同种和同龄的金鱼。选出的鱼必须先在与试验条件选出的鱼必须先在与试验条件相似的生活条件（温度、水质相似的生活条件（温度、水质等）下驯养等）下驯养7 d以上；试验前一以上；试验前一天停止喂食；如果在试验前天停止喂食；如果在试验前4 d天内发生死亡现象或发病的鱼天内发生死亡现象或发病的鱼高于高于10%，则不能使用。，则不能使用。n每一种浓度的试验溶液为一组，每组至少每一种浓度的试验

13、溶液为一组，每组至少10尾鱼尾鱼试验容器用容积约试验容器用容积约10L的玻璃缸，保证每升水中鱼的玻璃缸，保证每升水中鱼重不超过重不超过2g。n试验溶液的温度要适宜，对冷水鱼为试验溶液的温度要适宜，对冷水鱼为1228，对温水鱼为对温水鱼为2028。同一试验中，温度变化为。同一试验中，温度变化为2。n试验溶液中不能含大量耗氧物质，要保证有足够试验溶液中不能含大量耗氧物质，要保证有足够的溶解氧，对于冷水鱼不少于的溶解氧，对于冷水鱼不少于5mg/L，对于温水鱼，对于温水鱼不少于不少于4mg/L。n试验溶液的试验溶液的pH值通常控制在值通常控制在6.78.5之间。之间。n配制试验溶液和驯养鱼用水应是未受

14、污染的河水配制试验溶液和驯养鱼用水应是未受污染的河水或湖水。如果使用自来水，必须经充分曝气才能或湖水。如果使用自来水，必须经充分曝气才能使用。不宜使用蒸馏水。使用。不宜使用蒸馏水。试验溶液浓度设计试验溶液浓度设计 确定试验溶液的浓度范围确定试验溶液的浓度范围试验试验 记录不同时间的金鱼成活数记录不同时间的金鱼成活数毒性判定毒性判定计算半数忍受限度（计算半数忍受限度（TLmTLm）预试验预试验( (探索性试验探索性试验) ) 通常选七个浓度通常选七个浓度(至少五个至少五个)半数忍受限度（TLm），即半数存活浓度。又称半数耐受浓度或半数存活浓度。是水体污染物对鱼类急性毒性的一种指标，其概念与半数致

15、死浓度 (LC50)基本相同。一般以48TLm (mg/L) 表示。如某化学物质对鲤鱼的48TLm值为45mg/L。此45mg/L即为鲤鱼对该物质48小时内的半数耐受限度。现在已很少使用TLm法，一般用半数致死浓度 (LC50) 来表示2 2、发光细菌法、发光细菌法发光细菌：能自发发光的细菌，非致病、革兰氏发光细菌：能自发发光的细菌，非致病、革兰氏阴性兼性厌氧微生物阴性兼性厌氧微生物发光机制：菌体内有一种荧光素酶，通过酶催化发光机制：菌体内有一种荧光素酶，通过酶催化不饱和脂肪酸反应，而向外界辐射蓝绿色的荧光，发不饱和脂肪酸反应，而向外界辐射蓝绿色的荧光，发光光谱范围在光光谱范围在4354356

16、30nm630nm，有单一最大发射峰，有单一最大发射峰(maxmax=475nm).=475nm).特点：发光细菌易培养、增殖速度快、发光易受特点：发光细菌易培养、增殖速度快、发光易受外界环境的影响且反应迅速、灵敏等外界环境的影响且反应迅速、灵敏等GB/T15441-1995:HgClGB/T15441-1995:HgCl2 2为参比毒物为参比毒物Beckman公司依据发光细菌的发光原理公司依据发光细菌的发光原理,已推出用于环境监测的生物毒性检测仪已推出用于环境监测的生物毒性检测仪Microtox。半数有效浓度半数有效浓度EC50（1 1）水生植物生产力的测定）水生植物生产力的测定水生植物中叶

17、绿素含量、光合作用能力、水生植物中叶绿素含量、光合作用能力、固氮能力等指标的变化。固氮能力等指标的变化。 （2 2）致诱变物质监测）致诱变物质监测其检测方法有：其检测方法有：微核测定微核测定艾姆斯（艾姆斯（AmesAmes）试验）试验染色体畸变试验染色体畸变试验 诱变剂导致染色体复制时产生游离染色体断片、形诱变剂导致染色体复制时产生游离染色体断片、形成包膜，变成大小不等的微核。成包膜，变成大小不等的微核。生物材料：紫露草花粉母细胞、蚕豆根尖细胞生物材料：紫露草花粉母细胞、蚕豆根尖细胞微核试验能检出断裂剂又能检出有丝分裂毒物，从微核试验能检出断裂剂又能检出有丝分裂毒物，从而评价环境中致突变物对真

18、核细胞中染色体的损伤而评价环境中致突变物对真核细胞中染色体的损伤程度。程度。微核观察技术简单而省时，近年大有取代染色体分微核观察技术简单而省时，近年大有取代染色体分析之势。析之势。 污染物致突变性检测，也称为污染物致突变性检测，也称为鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验。检测检测DNADNA碱基序列碱基序列是否发生改变即基因突变是否发生改变即基因突变的一种方法的一种方法原理原理野生型野生型his+营养缺陷型营养缺陷型his-正向突变正向突变回复突变回复突变S9混合液：雄性大鼠肝脏匀浆物上清液混合液：雄性大鼠肝脏匀浆物上清液+辅辅酶酶 +G-6-P诱变剂诱变剂Ames试验Ames试验的应用实例：国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”，由于其药效显著，在60-70年代十分流行。但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”，后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用，但如果能在这种药物上市之前就进行但如果能在这种药物上市之前就进行AmesAmes试验检测，那么这种大试验检测，那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免。量出生畸形儿的悲剧完全可以避免。检验细菌总数，尤其是粪便污染指示细菌，间接检验细菌总数，尤其是粪便污染指示细菌，间接判断水底卫生学质量判断水底卫生学质量