医用消毒型超声耦合剂体外细胞毒性检测的探讨

1、医用消毒型超声耦合剂体外细胞毒性检测的探讨 本文档格式为WORD,感谢你的阅读。 【摘 要】应用MTT比色法和琼脂扩散法检测医用消毒型超声耦合剂的体外细胞毒性。用MTT比色法检测时，同一浸提液在细胞接种密度高时，显示出的毒性级别低，反之亦然。同一试验材料采用琼脂扩散法检测时的结果与MTT比色法有区别。由于MTT比色法具有定量评价的优点，更适合耦合剂产品的体外细胞毒性检测。但是由于消毒型耦合剂含有消毒剂成份，在评价其毒性时应充分考虑到消毒剂对细胞的毒性作用，明确试验条件和浸提液制备方法。建议进一步完善医用超声耦合剂产品的体外细胞毒性检测方法。 【关 键 词】医用消毒型超声耦合剂；细胞毒性；琼脂扩

2、散法；MTT比色法 R187 A 医用超声耦合剂发端于西方发达国家，是超声诊断与治疗操作中的专用制剂，然而，迄今为止国际组织和发达国家均不曾制定过相应的技术标准1。为了确保其符合安全、有效的原则，第一版的耦合剂行业标准由国家食品药品监督管理局于1998年颁布实施。随着耦合剂产品的发展，除了用于完好皮肤的普通型制剂外，还出现了无菌型及消毒型等类型的产品。2010颁布实施的新版医用超声耦合剂标准（YY02992008）对该类产品的生物相容性提出了要求。标准中要求按照GB/T16886.5-2003中规定的直接接触法进行试验，在短时间（24h以内）接触条件下，产品应无细胞毒性2。细胞毒性试验作为评价

3、材料毒性的重要指标，以其简便、快捷、灵敏性高、重现性好、节省动物，并且试验结果有一定的临床相关性等优点被列为首选试验项目3。GB/T16886.5-2003中规定了3类试验方法，即浸提液试验、直接接触试验以及间接接触试验（包括琼脂覆盖法和滤膜扩散法）4,5。ISO10993-5:2009标准的附录C规定了MTT法检测细胞毒性的试验步骤。本试验选取了消毒型超声耦合剂，在不同的试验条件下采用MTT法以及间接接触法中的琼脂覆盖法对其进行细胞毒性评价，以探讨消毒型医用超声耦合剂体外细胞毒性的检测方法。 1材料与方法 1.1试验材料 试验细胞选取L929小鼠成纤维细胞株，购自中国科学院上海细胞所。主要药

4、品与试剂：RPMI1640培养液（GIBCO，USA），胎牛血清（杭州四季青生物工程公司），MTT（AMRESCO，USA），DMSO（AMRESCO，USA）。 1.2试验方法 1.2.1四唑盐（MTT）比色法 取消毒型医用超声耦合剂，按照1mg/mL、5mg/mL、25mg/mL、100mg/mL及200mg/mL的比例分别加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液并置于37放置24h制备浸提液。取高密度聚乙烯浸提液作为阴性对照品；5%的DMSO溶液作为阳性对照。将培养至近汇合的L-929细胞消化，稀释为1×104U/mL及1×105U/mL，分别接种于96孔培养板中

5、，每孔加入100L。在37、5%CO2培养箱中培养24h，待细胞贴壁后将每孔中原培养液吸除，空白对照组加新鲜培养液200L，各组加200L不同浓度的浸提液以及阴性和阳性对照样品浸提液，置CO2培养箱中继续培养。于更换培养液后的24h将细胞接种密度为105个的培养板取出，置倒置显微镜下观察细胞形态。并每孔加入20L质量浓度为5g/L的MTT溶液，继续培养4h后弃去孔内液体，加入200L DMSO，置振荡器上振荡10min后，选择570 nm 在ELX800UV型酶标仪上测定光密度（optical density, OD）值，按以下公式计算相对增殖率(relative growth rare，RG

6、R)：RGR=实验组吸光度值对照组吸光度值×100，并判定细胞毒性级别。 于更换培养液后的72h将细胞接种密度为104个的培养板取出重复以上MTT实验。 1.2.2琼脂扩散法 将培养至近汇合的细胞稀释成2.5×105U/mL接种于6孔培养板中，设阴性对照组、阳性对照组及样品组，每组设3个平行样，各孔加入2mL，放于CO2培养箱中培养至近汇合状态。将溶化的琼脂培养基与2倍浓缩的含10血清的RPMI 1640培养基等比混合制成混合琼脂培养基，使琼脂的最终浓度为2。弃去上清后每孔加入2mL混合琼脂培养基，待琼脂层凝固后，分别加入2mL新鲜配制的0.01%中性红活体染色剂，置于暗处

7、染色20min后取出，吸除多余的染色剂，分别取无菌型及消毒型医用超声耦合剂均匀涂布于无菌滤纸片上并放置于固化的琼脂层上，样品约覆盖细胞层表面十分之一，阴性对照选用直径约5mm、厚约2mm的高密度聚乙烯圆片，阳性对照选用直径约5mm用20苯酚溶液浸湿的医用明胶海绵，置CO2培养箱中继续培养24h后于倒置显微镜下观察细胞溶解及褪色的情况，并对细胞毒性的级别进行判定。 1.3数据处理 数据以平均值±标准误（Mean±SEM）表示，用计算机统计软件包Statistica对数据作Studentst检验，确定差异显著性。 2结果 2.1四唑盐（MTT）比色法 表1、表2分别为消毒型医用

8、超声耦合剂在不同的浸提比例的情况下，对不同接种密度的L-929细胞增殖度的影响以及细胞毒性的反应级别。由表1可以看出，在细胞接种密度为104U/mL时，消毒型超声耦合剂对L-929细胞的增殖率是存在影响的。在浸提比例为1mg/mL、5mg/mL时，细胞毒性反应为1级、2级，而当浸提比例超过5mg/mL时，耦合剂对细胞的毒性作用极其显著，达到4级。表2显示，在细胞密度为105U/mL的体系中，浸提比例达到100mg/mL及以上时，消毒型超声耦合剂浸提液显示出对细胞有显著的毒性作用，细胞毒性达4级。 表1医用消毒型超声耦合剂的细胞相对增殖率 表2医用消毒型超声耦合剂的细胞相对增殖率 2.2琼脂扩散

9、法 表3显示，用琼脂扩散法检测消毒型医用超声耦合剂的细胞毒性为2级。 表3医用消毒型超声耦合剂琼脂扩散法结果 3讨论 医用超声耦合剂是一种很特殊的制剂，其功能是超声诊断仪的辅助和延伸，在用法上是与外用药品、化妆品相似的医疗用品。耦合剂应具备导声性能好、图像清晰、分辨力高；对人无毒无刺激，与皮肤粘膜生物相容性好；不损伤超声探头，不污染衣物等特点6。耦合剂的质量直接影响到图像清晰度和分辨力，同时耦合剂又是超声探头与皮肤病原微生物交叉传播的主要途径7。随着医用超声检查技术在临床上的广泛应用和医院感染控制需求的提升，超声探头的清洁与消毒越来越受到关注8,9。经过30多年的发展，医用超声耦合剂的配方几经

10、更新换代，陆续出现了用于腔内和术中的无菌型凝胶制剂，少数企业已研制生产了消毒型制剂。为了保证临床使用的安全性，新版的医用超声耦合剂标准将老版本上的“卫生要求”改为了“生物相容性”，删除原版本中对菌落数的限制和不得检出致病菌的要求，并按照生物学评价的思路，针对在完好皮肤上使用的特点，改为在短时间（24h）接触条件下产品对皮肤无细胞毒性、无致敏、无刺激1。可见，生物相容性是保证耦合剂产品安全有效性的重要指标。该标准中要求用直接接触法检测耦合剂的细胞毒性，但是该方法对材料的要求较高，耦合剂产品为凝胶状无固定形状，并且具有一定的水溶性，故采用该方法在实际操作中会出现很多问题。 本试验采用的MTT比色法

11、是浸提液法的一种，用于细胞毒性的定性和定量评价，该法对受试材料溶出物的毒性检测敏感性较高，也比较符合动物体内的毒性实验结果3。结果显示，消毒型医用超声耦合剂对L-929细胞具有一定的毒性作用，且与其产品类型及添加成份相关，并表现出一定的剂量依赖性。利用MTT法检测耦合剂的细胞毒性时，同一浸提比例的试验结果在不同的细胞接种密度及作用时间下显示出较为明显的差异。如浸提比例为25mg/mL时，细胞接种密度为1×104个/mL、作用时间为72h的细胞毒性就已达到4级，重度细胞毒性；而密度为1×105个/mL、作用时间为24h时，在浸提比例为25mg/mL时，显示出2级、轻微细胞毒性

12、。这些结果显示，在同一浸提比例下，细胞接种密度大的所反映出的毒性作用小，即高接种密度降低了细胞对毒性的敏感程度。当毒性物质的量一定而细胞接种密度适宜时，作用时间越长，实验组与空白对照组的正常细胞差距越大，表现出的毒性作用越明显10。 本试验采用的另一种方法琼脂覆盖法是间接接触法的一种，该方法对材料的要求比直接接触法低，使用的材料范围广，其缺点是受溶出物在琼脂上扩散程度的影响，当溶出物分子量小，易溶于水，其敏感性就高，反之则低3。该方法是一种定性评价方法，在结果判定时褪色区域的大小及溶解细胞的比例都是通过实验者的观察实现的，受到一定的主观影响。在本试验中，结果显示该消毒型耦合剂体外细胞毒性为2级

13、，但不能对其结果作出量化的比较。 本研究试验结果提示，细胞毒性检测结果与所选用的试验方法密切相关。而在现今医疗器械体外细胞毒性检测最常用的MTT比色法中，浸提液制备方法、细胞接种密度以及浸提液作用时间等是影响检测结果的关键因素。浸提液制备方法直接决定了作用于细胞的毒性物质的多少，而细胞接种密度关系到细胞对一定量的毒性物质的敏感程度10。 由此可见，不同的细胞毒性检测方法、原理各不相同，而每一检测方法中存在很多会直接影响检测结果的因素，因此，根据试验材料的理化性质、毒性作用机理及其最终的使用途径正确的选择适宜的检测方法十分重要。由于医用消毒超声耦合剂含有消毒剂成份，该成份既能杀灭微生物，对细胞必

14、定存在毒性作用，而且消毒剂的品种不同，对细胞的毒性机理就不同，产生的细胞毒性也会不一样，所以对该类产品而言，如何更科学、更准确的评判其细胞毒性的方法有待进一步的研究和明确。 参考文献 1牛凤岐，朱承纲，程洋.医用超声耦合剂超声科医师应该了解的知识和信息J.中国医学影像技术，2009,25(4):715-717. 2 YY0299-2008. 医用超声耦合剂S.国家食品药品监督管理局，2009. 3 贾文英，史弘道. 细胞毒性试验评价医用装置生物相容性的研究概况J. 实用美容整形外科杂志，2001，12(5):253-255. 4 由少华. 解读GB/T 16886医疗器械生物学评价系列标准J.

15、 中国医疗器械信息，2005，11(1):15-19. 5 GB/T16886.5-2003.医疗器械生物学评价第5部分体外细胞毒性试验S. 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，2003. 6 林必杰，林辉我国医用超声耦合剂现状和质量标准的探讨J中国药学杂志，1996，31(11):690-691. 7 鞠方涛，王秋红，崔满春，张斌，陈会军一种医用超声耦合剂消毒凝胶杀菌效果和毒性观察J中国消毒学杂质，2013，30(4):303-305,308. 8 薛广波现代消毒学M北京：人民军医出版社，2002:369. 9 陈越英，奚清丽，徐燕，等过氧化氢除菌洗手液杀菌性能与毒性的实验研究J现代预防医学，2005，32(9):1167-1168. 10 高静贤，王莎莎，金梦，严小莉.医用超声耦合剂体外细胞毒性检测的探讨J .中国医疗器械杂志，2013,37(3):237-239. 文档资料：医用消毒型超声耦合剂体外细胞毒性检测的探讨 完整下载 完整阅读 全文下载 全文阅读 免费阅读及下载阅读相关文档:议城市排水管网的建设 议公路工程施工的现场质量管理 迎宾大道绿化种植设计 影响电商物流中心作业流程及工艺布局的因素研究 用电监察工作中的防窃电策略 优化建筑施工管理提高建筑工程质量 优化施工组织设计降低工程造价 有关电力输电线路的防雷保护措施探讨 预应力混凝土桥梁张拉技术的应用分析 预应